Nghiệm Pháp Miễn Dịch Hóa Phát Quang Định Lượng

‡) Bác sĩ chẩn đoán nhiễm trùng huyết bao gồm các triệu chứng nhiễm trùng, nhiễm độc toàn thân phù hợp với nhiễm trùng huyết (sốt

> 380C hoặc hạ nhiệt < 360C, rét run, hạ huyết áp [huyết áp tâm thu < 90 mmHg], nhịp nhanh, tăng bạch cầu, giảm tiểu cầu, nhiễm acid, …). Đối với trẻ ≤ 1 năm: sốt > 380C hoặc hạ nhiệt < 370C, ngạt thở hoặc mạch chậm [3], [76], [85].

‡) Và / hoặc cấy máu dương tính ít nhất 1 lần, ngoại trừ cấy catheter [39], [76], [133].

Nhiễm trùng huyết do catheter được chẩn đoán khi có ít nhất 1 lần cấy máu dương tính từ máu tĩnh mạch ngoại vi, biểu hiện lâm sàng nhiễm trùng huyết (sốt > 380C, rét run và / hoặc hạ huyết áp) và không có nguồn nhiễm trùng huyết khác ngoài cấy catheter dương tính [76].

Chẩn đoán nhiễm trùng huyết do khả năng vấy nhiễm từ da (tụ cầu coagulase âm tính hoặc nhóm liên cầu viridan) cần phải phân lập cùng một loại vi khuẩn từ ít nhất 2 lần cấy máu dương tính hoặc 1 lần cấy máu dương tính ở những bệnh nhân chỉ được thực hiện cấy máu 1 lần [133].

Chẩn đoán nhiễm trùng huyết nhiều vi sinh vật khi phân lập có ít nhất 2 loại vi sinh vật trong cùng một mẫu cấy máu trong vòng 48 giờ hoặc phân lập 1 loại tác nhân gây bệnh đã biết và 1 hay nhiều tác nhân có khả năng vấy nhiễm từ da từ ít nhất 2 lần cấy máu dương tính [133].

†) Nhiễm trùng catheter: những trường hợp không được chẩn đoán nhiễm trùng huyết, cấy máu nhiều lần âm tính nhưng cấy catheter dương tính chúng tôi xếp vào nhiễm trùng catheter.

†) Nhiễm trùng tĩnh mạch trung tâm: được chẩn đoán nếu bệnh nhân có các dấu hiệu nhiễm trùng và/ hoặc cấy máu dương tính trước hoặc trong vòng 48 giờ sau khi rút catheter tĩnh mạch trung tâm và nuôi cấy đầu catheter dương tính (≥ 1000 đơn vị khuẩn lạc) [152].

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 171 trang tài liệu này.

†) Viêm nội tâm mạc: chẩn đoán nhiễm trùng trong tim sau phẫu thuật khi có ít nhất 1 trong các tiêu chuẩn sau: 1) được xác định bằng siêu âm tim (vết sùi) hoặc cấy máu dương tính. Những trường hợp nghi ngờ, các biểu hiện khác như nhồi máu phổi hoặc lách, huyết khối tắc mạch đủ để chẩn đoán.

2) Bệnh nhân có ít nhất hai trong các tiêu chuẩn sau: sốt > 380C, xuất hiện mới hoặc thay đổi tiếng thổi (murmur), nhồi máu, biểu hiện da (chấm xuất huyết, mảng xuất huyết, nốt dưới da đau), suy tim xung huyết hoặc bất thường điện tim, bác sĩ điều trị viêm nội tâm mạc. Đối với trẻ ≤ 1 năm kết hợp thêm biểu hiện sốt > 380C hoặc hạ nhiệt < 370C, ngạt thở hoặc nhịp chậm [39], [85].

†) Nhiễm trùng trung thất: có dấu hiệu nhiễm trùng, đau ngực hoặc xương ức không vững và có ít nhất 1 trong các tiêu chuẩn sau: 1) Dẫn lưu trung thất hoặc chảy mủ từ trung thất, 2) Cấy vi khuẩn dương tính, 3) Giãn rộng trung thất trên X quang hoặc 4) Điều trị kháng sinh hoặc kháng nấm [39], [85].

†) Nhiễm trùng xương ức: có dấu hiệu nhiễm trùng, đau xương ức hoặc xương ức không vững và có ít nhất 1 trong các tiêu chuẩn sau:

1) Đường mổ được mở dẫn lưu dịch hoặc cắt lọc vết mổ ngực, 2) Cấy vi khuẩn dương tính [39], [65].

†) Nhiễm trùng vết mổ (nông hoặc sâu): được chẩn đoán nếu xảy ra trong vòng 30 ngày sau phẫu thuật và có ít nhất 1 trong các tiêu chuẩn sau: chảy mủ vết mổ, phân lập được vi khuẩn và tối thiểu có một trong các dấu hiệu và triệu chứng viêm (sưng, nóng, đỏ, đau) [65], [152].

2.2.4.2. Đặc điểm cận lâm sàng

- Siêu âm tim

Chẩn đoán bệnh TOF và theo dõi phân suất tống máu thất trái (%) trước và sau phẫu thuật.

- Bộ xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu

+ Xét nghiệm thường quy: ghi nhận qua bệnh án 8 ngày từ 1 ngày trước

phẫu thuật (N0), ngày phẫu thuật (N1), ngày thứ 2 (N2) đến ngày thứ 7 sau phẫu thuật (N7) bao gồm:

* Đếm tế bào máu: hồng cầu (bình thường: 4 - 5,8 x 109/L),

hemoglobine (12 - 16,5 g/dL), thể tích huyết cầu (hematocrit: 34 - 51%); BC (4

- 10 x 106/L), BCTT (2,5 - 7,5 x 106/L), lympho (1,5 - 4 x 106/L) và tiểu cầu (150 - 450 x 106/L)

* Cầm máu đông máu: 2 thời điểm trước và sau phẫu thuật gồm 3 xét nghiệm thường quy: tỷ prothrombin (%) (bình thường: ≥ 70%); thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (giây) (bình thường: 28 - 42 giây) và fibrinogen (g/L) (bình thường: 1,5 - 2 g/L) [15]

* Các xét nghiệm hóa sinh:

†) Chức năng gan: bilirubin toàn phần (bình thường 0 - 19 μmoL/L), SGOT (0 - 38 U/L), SGPT (0 - 41 U/L)

†) Chức năng thận: ure (bình thường: 1,7 - 8,3 mmol/L), creatinin (bình thường: Nam: 63 - 115; Nữ: 53 - 100 μmol/L)

†) Glucose máu (bình thường: trẻ em: 2,6 - 4,5; người lớn: 3,5 - 6,4 mmol/L) [134]

†) Khí máu: chỉ xét nghiệm sau phẫu thuật bao gồm pH (bình thường 7,35 - 7,45), PaCO2 (35 - 45 mmHg), PaO2 (70 - 100 mmHg), kiềm

dư (± 2 mmol/L), HCO3- (22 - 30 mmol/L), SaO2 (75 - 99%) [127]. FiO2 (%)

chỉ theo dõi qua máy thở.

+ Các xét nghiệm MD: hai thời điểm chính là 1 ngày trước ngày phẫu thuật (N0) và ngày thứ hai sau phẫu thuật (N2) khi đáp ứng viêm cao nhất [50], [126], [167].

* CRP (mg/dL): giới hạn bình thường từ 0,0 - 0,8 mg/dL [134]. CRP được phân thành 3 nhóm: < 5 mg/dL, 5 - 10 mg/dL và > 10 mg/dL [36], [52].

* IL-6 (pg/mL): giới hạn bình thường từ 0,0 - 5,9 pg/mL [158].

IL-6 được chia thành 4 nhóm: < 250 pg/mL, 250 - 500 pg/mL,

> 500 - 1000 pg/mL và > 1000 pg/mL [112], [166].

* IL-10 (pg/mL): giới hạn bình thường từ 0,0 - 9,1 pg/ mL [159].

IL-10 được chia thành 4 nhóm: < 85 pg/mL, 85 - 125 pg/mL,

> 125 - 250 pg/mL và > 250 pg/mL [69], [112].

Khi hai kết quả interleukin dưới ngưỡng đo của máy (IL-6 < 2 pg/mL và IL-10 < 5 pg/mL) [160], kết quả sẽ được tính bằng không.

* Sử dụng tỉ lệ IL-6/IL-10 ở mỗi thời điểm xét nghiệm để đánh giá tình trạng mất cân bằng cytokine [183].

+ Cấy vi khuẩn: cấy bệnh phẩm mủ, máu, nước tiểu, ...

2.2.5. Phương tiện nghiên cứu

2.2.5.1. Bệnh án nghiên cứu

Bệnh án nghiên cứu được soạn thảo theo mẫu thống nhất (phụ lục1).

2.2.5.2. Phương tiện xét nghiệm

Tất cả các xét nghiệm tiến hành tại Khoa Xét nghiệm Huyết học - Trung tâm Huyết học Truyền máu, Khoa Hóa sinh và Khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Huế.

+ Xét nghiệm huyết học

* Máy đếm tế bào máu: máy Cell - Dyn 3200 của hãng Abbott - Hoa Kỳ. Máy gồm hai kênh: đo tế bào ở kênh quang học theo nguyên lý đếm tế bào dòng chảy và kênh đo hemoglobin theo nguyên lý so màu. Tiến hành lấy đủ 2 mL máu trong ống có chất chống đông EDTA. Những kết quả tiểu cầu

< 150 x 106/L đều được kéo lam nhuộm giêm - sa để loại trừ giảm tiểu cầu giả

do ngưng tập với EDTA.

* Máy xét nghiệm đông máu: máy STA compact tự động của hãng Diagnostica Stago - Pháp. Máy hoạt động theo nguyên lý đầu dò điện từ để phát hiện thời điểm đông. Máy có ưu điểm tránh được các sai số do mẫu thử như huyết tương giàu lipid, tăng bilirubin. Hoá chất xét nghiệm dùng của

chính hãng cung cấp. Lấy máu trong ống nghiệm có chất chống đông là citrat natri 3,2% theo tỉ lệ 1/ 9 (1 thể tích chống đông / 9 thể tích máu), điều chỉnh chất chống đông theo hematocrit. Xét nghiệm tiến hành trong vòng 4 giờ, bảo đảm đúng các tiêu chuẩn lấy máu của phòng xét nghiệm đông máu.

+ Xét nghiệm hoá sinh và miễn dịch:

* Máy phân tích khí máu hiệu Medica Easy Blood Gas của Hãng Medica Hoa Kỳ: máy được thiết kế để đo trực tiếp pH (hoạt tính ion hydro), PaCO2 (áp suất riêng phần CO2) và PaO2 (áp suất riêng phần O2) trên các mẫu máu toàn phần lấy bằng các ống tiêm hoặc ống mao mạch có tráng heparin. Các kết quả thường được điều chỉnh theo nhiệt độ do đó phản ánh chính xác các tình trạng in vivo. Trên cơ sở pH, PaCO2, PaO2 và các tham số bổ sung như nhiệt độ, hemoglobine, ... máy sẽ tính toán bổ sung các kết quả khác như HCO3-, kiềm dư, SaO2, ...

* Máy OLYMPUS AU640 của Nhật: xét nghiệm bilirubin, creatinin, CRP và glucose.

†) Định lượng bilirubin: xét nghiệm so màu để định lượng bilirubin toàn phần trong huyết thanh hoặc huyết tương người. Nguyên tắc xét nghiệm: muối diazonium ổn định phản ứng trực tiếp với bilirubin liên hợp và phản ứng với bilirubin không liên hợp khi có sự hiện diện của yếu tố xúc tác để hình thành azobilirubin. Sự hấp phụ ở bước sóng 540 nm tỷ lệ với nồng độ bilirubin toàn phần.

†) Định lượng creatinin: sử dụng phương pháp so màu động học Raffe. Nguyên lý: creatinin phản ứng với acid picric trong môi trường kiềm tạo thành phức hợp màu cam. Tốc độ thay đổi mật độ quang đo ở bước sóng 520/800 nm tỷ lệ thuận với nồng độ creatinin trong mẫu.

†) Định lượng CRP: phương pháp miễn dịch đo độ đục (immunonephelometry) của phản ứng kháng nguyên - kháng thể giữa kháng thể dê kháng CRP người và CRP trong mẫu xét nghiệm.

†) Định lượng glucose: phương pháp so màu, sử dụng enzym

hexokinase (HK) theo nguyên lý sau:

Glucose + ATP HK G-6-P + ADP

G-6-P + NAD G6PDH 6-Phosphogluconate +NADH + H+

Sự thay đổi mật độ quang ở 340/380 nm tỷ lệ thuận với lượng glucose có trong mẫu.

* Máy xét nghiệm IMMULITE 1000 của hãng Siemens - Hoa Kỳ: dùng để định lượng IL-6 và IL-10. Sử dụng bộ kít định lượng IL-6 và IL-10 của chính hãng cung cấp.

Nguyên lý: xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang (chemiluminescent immunometric assay) gắn enzym pha rắn.

Mẫu máu có thể sử dụng huyết thanh hoặc huyết tương (chống đông bằng heparin). Mẫu máu được ly tâm, tách huyết thanh, đông lạnh huyết thanh và bảo quản ở tủ đông lạnh sâu (-300C) của hãng SANYO - Nhật ở Ngân hàng Máu khu vực - Bệnh viện Trung ương Huế trước khi xét nghiệm, thời gian bảo quản mẫu đông lạnh cho phép kéo dài đến 6 tháng [158], [159].

Đây là phương pháp miễn dịch kiểu sandwich, được ứng dụng để định lượng các chất phân tích có nồng độ thấp, dễ dàng và nhanh chóng. Chất cần định lượng (IL-6 hoặc IL-10) là kháng nguyên được kẹp giữa 2 kháng thể đặc hiệu trong thuốc thử:

Anti-IL-6 + IL-6 + anti-IL-6 cộng hợp enzym

Chất đánh dấu là một enzym kết hợp với chất nền hóa phát quang sẽ phát sáng. Cường độ ánh sáng phát ra tỷ lệ với lượng enzym hiện diện và liên quan trực tiếp với lượng IL-6 có trong mẫu xét nghiệm (sơ đồ 2. 2).

Ngưỡng phát hiện của máy: IL-6: 2 - 1000 pg/mL ;

IL-10: 5 - 1000 pg/mL [160].

Đối với những kết quả trả lời bán định lượng > 1000 pg/mL, mẫu huyết thanh sẽ được hòa loãng 1/2 hoặc 1/4 , … để lặp lại xét nghiệm lần 2 hoặc lần

3 cho đến khi cho kết quả định lượng. Sau đó, kết quả sẽ được tính ngược với độ hòa loãng để trả lời kết quả của mẫu xét nghiệm.

Kháng thể bắt kháng nguyên được gắn cố định

Bổ sung kháng nguyên

Kháng thể thứ hai được đánh dấu

Bổ sung chất nền Phát hiện tín hiệu và định lượng

Cường độ tín hiệu

Rửa Rửa

Nồng độ chất phân tích Cường độ tín hiệu (ánh sáng) tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích

Sơ đồ 2.2. Nghiệm pháp miễn dịch hóa phát quang định lượng

* Nguồn: theo Rockland immunochemicals inc. (2012) [146]

+ Xét nghiệm vi sinh:

* Đàm, mủ, nước tiểu: phương pháp trực tiếp nhuộm Gram, đếm bạch cầu, ... tìm vi khuẩn.

* Cấy máu: trên môi trường Mac Conkey ở máy cấy máu BacT/ALERT của hãng BIORAD - Pháp.

* Cấy các bệnh phẩm khác theo quy trình thường quy của Khoa Vi sinh trên các môi trường thạch dinh dưỡng và thạch máu.

* Cấy nấm trên môi trường Sabauraud.

* Kháng sinh đồ trên môi trường Mueller - Hinton.

2.2.5.3. Thăm dò chức năng

Đo điện tâm đồ, siêu âm tim, X quang ngực trước phẫu thuật thực hiện tại Khoa Thăm dò Chức năng Tim mạch và Khoa X quang Bệnh viện Trung ương Huế, sau phẫu thuật tiến hành tại giường ở Khoa Hồi sức tim - Trung tâm Tim mạch - Bệnh viện Trung ương Huế.

2.2.6. Quy trình nghiên cứu

2.2.6.1. Quy trình phẫu thuật

Tất cả bệnh nhân TOF chọn vào mẫu nghiên cứu đều được phẫu thuật theo quy trình chuẩn với cùng một nhóm gây mê hồi sức, phẫu thuật và chạy THNCT. Khi về phòng ICU, bệnh nhân được theo dõi và điều trị với cùng một đội ngũ bác sĩ và điều dưỡng Khoa Gây mê Hồi sức tim – Bệnh viện Trung ương Huế.

- Chuẩn bị trước phẫu thuật

+ Nội khoa: propanolol, thuốc an thần hydroxyzine (Atarax) được cho vào đêm trước mổ và sáng trước khi vào phòng mổ.

+ Phẫu thuật tạm thời: phẫu thuật cầu nối chủ - phổi trái hoặc phải [25].

- Phẫu thuật:

+ Gây mê

* Gây mê bằng fantanyl, norcuron, diprivan, ketamine và morphine ...

* Sử dụng GC: DEXA liều trung bình 1 mg/kg khi khởi mê hoặc MP liều trung bình 30 mg/kg hòa vào dịch mồi THNCT hoặc không sử dụng GC.

* Kháng sinh dự phòng: tất cả bệnh nhân đều được sử dụng kháng sinh dự phòng trước phẫu thuật và duy trì đến khi ra khỏi phòng hồi sức tim trừ những trường hợp có biểu hiện nhiễm trùng sẽ sử dụng kéo dài hơn. Kháng sinh thường sử dụng là cephalosporine thế hệ III.

* Dự phòng tiêu sợi huyết bằng acid tranexamic, liều trung bình 50 mg/kg chia 2 lần trước và sau THNCT. Nếu sau phẫu thuật chảy máu quá mức, sử dụng thêm 1 - 2 liều bổ sung.

+ Tuần hoàn ngoài cơ thể và phẫu thuật

* Mở xương ức, cắt bỏ một phần hay toàn bộ tuyến ức giúp bộc lộ vị trí chia đôi động mạch phổi dễ dàng hơn.

* Đặt ống (canule) động mạch chủ và tĩnh mạch chủ để thiết lập vòng THNCT.