Kết quả thẩm định cho thấy thời gian lưu của pic mesalamin trên sắc ký đồ mẫu chuẩn là 13,95 phút; mẫu thử là 13,80 phút. Sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử có pic có thời gian lưu tương đương thời gian lưu của pic mesalamin trong dung dịch chuẩn, đồng thời mẫu giả dược và mẫu trắng không có pic trùng với pic trên. Như vậy quy trình phân tích có tính đặc hiệu.
3.1.2.2. Tính phù hợp của hệ thống
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống
Lần đo | tR (phút) | S (mAu x phút) | AS | N | R | |
3- Aminosalisylic | TB | 10,071 | 282116 | 1,026 | 20316 | - |
SD | 0,02 | 275,93 | 0,00 | 148,21 | - | |
RSD % | 0,19 | 0,11 | 0,33 | 0,73 | - | |
Mesalamin | TB | 13,856 | 4899016 | 1,251 | 17139 | 4,153 |
SD | 0,05 | 1284,23 | 0,00 | 94,47 | 0,04 | |
RSD % | 0,41 | 0,03 | 0,31 | 0,55 | 0,93% | |
Acid salicylic | TB | 17,931 | 234001 | 1,100 | 18053 | 3,298 |
SD | 0,08 | 1117,91 | 0,00 | 213,38 | 0,01 | |
RSD % | 0,51 | 0,52 | 0,28 | 1,18 | 0,33% |
Có thể bạn quan tâm!
-
Thẩm Định Các Phương Pháp Định Lượng Mesalamin -
Đánh Giá Nghiên Cứu Tiền Công Thức -
Điều Kiện Bảo Quản Và Thời Gian Kiểm Tra Độ Ổn Định -
Độ Ổn Định Của Mes Huyết Tương Trong Các Điều Kiện Khác Nhau (N=6) -
Kết Quả Thử Độ Hòa Tan Của Các Mẫu Pellet Sử Dụng Chất Hóa Dẻo Khác Nhau (N = 6) -
Kết Quả Thử Độ Hòa Tan Của Các Mẫu Pellet Bào Chế Với Bề Dày Màng Bao Khác Nhau (N = 6)
Xem toàn bộ 299 trang tài liệu này.
tR: thời gian lưu; S: diện tích pic; As: hệ số bất đối; N: số đĩa lý thuyết; R: độ phân giải
Kết quả phân tích cho thấy hệ số bất đối của pic 3-aminosalisylic, mesalamin và acid salisylic đều nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. RSD của các thông số sắc ký cho các lần tiêm lặp lại đều < 2 %. Vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp hệ thống.
3.1.2.3. Tính tuyến tính
Kết quả khảo sát tính tuyến tính như sau
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ mesalamin và diện tích pic
Kết quả cho thấy hệ số R2 1 chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic.
3.1.2.4. Độ đúng
Kết quả thẩm định độ đúng như sau
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Tỷ lệ thu hồi (%) | Tỷ lệ thu hồi trung bình (%) | RSD (%) | |
80% (0,16 mg/ml) | 100,60 | 100,51 | 0,12 |
100,37 | |||
100,56 | |||
100% (0,20 mg/ml) | 99,57 | 99,79 | 0,25 |
99,73 | |||
100,06 | |||
120% (0,24 mg/ml) | 100,97 | 100,98 | 0,02 |
100,96 | |||
101,01 |
Kết quả cho thấy, tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ trong khoảng 98 – 102 % và RSD ≤ 2 %, do đó phương pháp đạt yêu cầu độ đúng.
3.1.2.5. Khoảng xác định
Từ kết quả thẩm định độ đúng và tính tuyến tính suy ra khoảng xác định của phương pháp: 0,16 mg/ml đến 0,24 mg/ml.
3.1.2.6. Độ chính xác
Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian như sau
Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ chính xác trung gian
Độ lặp lại (n = 6) | Độ chính xác trung gian (n = 12) | |
Hàm lượng | 100,53% | 100,38% |
RSD | 0,55% | 0,61% |
Kết quả cho thấy độ chính xác đạt yêu cầu (RSD < 2 %). Phương pháp đạt yêu cầu độ chính xác.
Như vậy, phương pháp HPLC đã xây dựng có khoảng tuyến tính thích hợp, độ đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác cao. Có thể áp dụng phương pháp HPLC với các điều kiện trên để định lượng mesalamin trong viên.
3.1.3. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng mesalamin trong huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
3.1.3.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc
Kết quả thẩm định độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp như sau
MS Chromatogram
153.9000>108.0500(+)@2
100.000
Mesalamine
100.000
284.9000>193.1500(+)@1
Diazepam
Intensity
75.0
25.0
75.0
25.0
2.5 5.0 7.5 10.0
min (a)
MS Chromatogram
153.9000>108.0500(+)@2
100.000
Mesalamine
100.000
284.9000>193.1500(+)@1
Diazepam
Intensity
75.0
25.0
75.0
25.0
2.5 5.0 7.5 10.0
min (b)
Hình 3.6. (a) sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng; (b) sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn MES ở nồng độ LLOQ (50 ng/ml) và IS
Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của mesalamin (2,3 phút) bằng 7,81 % đáp ứng của mesalamin ở nồng độ LLOQ (yêu cầu ≤ 20 %) và đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của diazepam (8,1 phút) bằng 1,31 % đáp ứng của diazepam (yêu cầu ≤ 5 %), do đó phương pháp đặc hiệu và chọn lọc theo hướng dẫn US-FDA.
3.1.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Pha dãy chuẩn có nồng độ 50 – 30000 ng/ml như bảng 3.7
Bảng 3.7. Cách pha dãy chuẩn nồng độ từ 50 – 30000 ng/ml
Blank | Zero | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | |
Nồng độ (ng/mL) | 0 | 0 | 50 | 100 | 250 | 500 | 1000 | 5000 | 20000 | 30000 |
V huyết tương trắng (µL) | 1000 | 1000 | 950 | 900 | 750 | 975 | 950 | 750 | 980 | 970 |
V chuẩn gốc (µL) | 0 | 0 | - | - | - | - | - | - | 20 | 30 |
VS7(µL) | 0 | 0 | - | - | - | 25 | 50 | 250 | - | - |
VS5(µL) | 0 | 0 | 50 | 100 | 250 | - | - | - | - | - |
Kết quả khảo sát đường chuẩn và khoảng tuyến tính như phương pháp trình bày ở mục 2.2.4 như sau
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỷ lệ diện tích pic MES/IS với nồng độ MES trong huyết tương (ng/ml)
Bảng 3.8. Độ đúng của các mẫu chuẩn
Độ chính xác so với nồng độ lý thuyết (%) | |||||
CC1 | CC2 | CC3 | CC4 | CC5 | |
S1 | 101,8 | 102,2 | 102,0 | 101,4 | 100,1 |
S2 | 98,4 | 97,6 | 97,6 | 99,0 | 100,7 |
S3 | 93,8 | 94,5 | 94,8 | 93,2 | 94,1 |
S4 | 104,6 | 104,3 | 104,6 | 105,6 | 109,3 |
S5 | 94,8 | 92,7 | 95,2 | 98,1 | 95,2 |
S6 | 99,8 | 101,5 | 97,5 | 98,0 | 101,4 |
S7 | 103,6 | 103,1 | 106,0 | 104,9 | 103,6 |
S8 | 103,1 | 104,1 | 102,3 | 99,8 | 95,6 |
Kết quả thẩm định cho thấy trong khoảng nồng độ 50 - 30000 ng/ml có sự tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic MES/IS và nồng độ MES với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1. Nồng độ MES xác định từ đường chuẩn so với nồng độ lý thuyết đều nằm trong giới hạn cho phép 85 – 115 % theo hướng dẫn của US-FDA.
3.1.3.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Bảng 3.9. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Mẫu trắng | Mẫu chuẩn (50ng/mL) | |||||||
MES | IS | MES | IS | Nồng độ tìm thấy(a) (ng/ml) | Độ đúng (b) (%) | Đáp ứng của mẫu LLOQ/mẫu trắng (S/N) | Đạt/ Không | |
1 | 774 | 2867 | 10745 | 220023 | 52,4 | 104,7 | 12,3 | Đạt |
2 | 1006 | 3260 | 11524 | 211856 | 57,1 | 114,0 | 13,2 | Đạt |
3 | 796 | 2034 | 10897 | 210804 | 54,8 | 109,5 | 12,5 | Đạt |
4 | 874 | 3418 | 12045 | 213609 | 58,8 | 117,4 | 13,8 | Đạt |
5 | 825 | 2393 | 10547 | 219141 | 51,8 | 103,5 | 12,1 | Đạt |
6 | 974 | 2859 | 11415 | 210955 | 56,9 | 113,5 | 13,0 | Đạt |
TB | 875 | 2805 | 11196 | 214398 | 55,3 | 110,4 | 12,8 | Đạt |
CV (%) | 5,0 | 5,0 | 5,0 | |||||
(a): tính từ phương trình hồi quy (b): % so với nồng độ thực
Kết quả cho thấy giới hạn định lượng dưới (LLOQ) đáp ứng yêu cầu US-FDA do tại cùng thời gian lưu, đáp ứng của mẫu chuẩn lớn hơn đáp ứng của mẫu huyết tương trắng > 5 lần; độ đúng trong khoảng 80% – 120% so với nồng độ thực.
3.1.3.4. Độ đúng và độ chính xác của phương pháp
Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác như sau:
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày (n=6)
Độ đúng (a) (%) | |||||
LLOQ ( 50 ng/ml) | LQC ( 150 ng/ml) | MQC ( 2000 ng/ml) | HQC ( 24000 ng/ml) | ||
1 | Min | 103,2 | 91,5 | 90,8 | 97,9 |
Max | 110,0 | 98,2 | 105,3 | 103,1 | |
TB | 106,3 | 94,5 | 96,4 | 101,1 | |
CV (%) | 2,3 | 2,5 | 5,9 | 2,3 | |
2 | Min | 95,8 | 98,3 | 96,6 | 93,9 |
Max | 112,0 | 106,6 | 110,9 | 104,2 | |
TB | 103,9 | 102,2 | 106,8 | 98,1 | |
CV (%) | 5,5 | 3,1 | 4,9 | 3,8 | |
3 | Min | 95,8 | 91,6 | 96,2 | 95,7 |
Max | 107,0 | 103,9 | 106,9 | 106,0 | |
TB | 102,8 | 96,7 | 101,4 | 99,8 | |
CV (%) | 4,6 | 5,5 | 3,7 | 3,9 | |
Min | 95,8 | 91,5 | 90,8 | 93,9 | |
Max | 112,0 | 106,6 | 110,9 | 106,0 | |
TB | 104,3 | 97,8 | 101,5 | 99,7 | |
CV (%) | 4,3 | 5,0 | 6,3 | 3,4 | |
(a): tính từ phương trình hồi quy; (b): % so với nồng độ thực
Ở các nồng độ trên, độ đúng trung bình trong ngày 1 từ 94,5 - 106,3% và khác ngày từ 97,8 - 104,3 %, đạt yêu cầu 85 - 115 %. Ngoài ra, độ chính xác trung bình
trong ngày 1 là 2,3 - 5,9 % và khác ngày là 3,4 - 6,3 %, đáp ứng các yêu cầu của US- FDA về độ đúng, độ chính xác ≤ 20 % đối với mẫu LLOQ và ≤ 15 % đối với các mẫu còn lại.
3.1.3.5. Độ đúng và độ chính xác của phương pháp khi pha loãng
Pha các mẫu AC1, AC2, AC3 như bảng 3.11.
Bảng 3.11. Cách chuẩn bị mẫu khảo sát độ đúng – độ chính xác khi pha loãng (AC)
Nồng độ (ng/mL) | V huyết tương trắng (µL) | V chuẩn gốc (µL) | V AC3 (µL) | V AC2 (µL) | |
AC1 | 300 | 740 | - | - | 60 |
AC2 | 4000 | 550 | - | 50 | - |
AC3 | 48000 | 952 | 48 | - | - |
Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác khi pha loãng như sau:
Bảng 3.12. Kết quả độ đúng, độ chính xác của phương pháp khi pha loãng (n=6)
Độ đúng (a) (%) | |||
AC1 ( 300 ng/ml) | AC2 ( 4000 ng/ml) | AC3 ( 48000 ng/ml) | |
Min | 96,2 | 97,1 | 95,2 |
Max | 105,7 | 111,3 | 109,5 |
TB | 100,6 | 105,4 | 99,9 |
CV (%) | 4,1 | 5,0 | 5,9 |
(a): tính từ phương trình hồi quy; (b): % so với nồng độ thực
Ở các nồng độ trên, độ đúng trung bình từ 99,9 - 105,4% đạt yêu cầu 85 - 115
%. Ngoài ra, độ chính xác trung bình từ 4,1 - 5,9 % đáp ứng các yêu cầu ≤ 15%.
3.1.3.6. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp
Tỷ lệ thu hồi của MES và chuẩn nội diazepam
Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi MES và IS như sau
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của MES và IS (n=6)
Đáp ứng MES | Đáp ứng IS | |||||||
LQC ( 150 ng/mL) | MQC ( 2000 ng/mL) | HQC ( 24000 ng/mL) | ||||||
Huyết tương | Dung môi | Huyết tương | Dung môi | Huyết tương | Dung môi | Huyết tương | Dung môi | |
Min | 30649 | 33143 | 48287 | 53848 | 7452784 | 7940678 | 210154 | 240472 |
Max | 34522 | 34429 | 53069 | 57504 | 7938438 | 8069992 | 230833 | 258610 |
TB | 32313 | 33912 | 50498 | 55693 | 7769324 | 8013830 | 221295 | 249875 |
CV (%) | 5,0 | 1,3 | 4,2 | 2,8 | 3,0 | 0,6 | 3,3 | 2,6 |
Tỷ lệ thu hồi (%) | 95,3 | 90,7 | 96,9 | 88,6 | ||||
Kết quả cho thấy phương pháp xử lý mẫu cho hiệu xuất chiết mesalamin, diazepam cao, ổn định (sai khác giữa các nồng độ không quá 10%) đáp ứng yêu cầu US-FDA.
3.1.3.6. Xác định ảnh hưởng của nền mẫu
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu (n=6)
MFMES | MFIS | MFMES/MFIS | ||||
LQC | HQC | LQC | HQC | LQC | HQC | |
Min | 0,94 | 0,92 | 0,82 | 0,84 | 1,03 | 1,01 |
Max | 1,02 | 0,99 | 0,93 | 0,92 | 1,23 | 1,17 |
TB | 0,98 | 0,97 | 0,87 | 0,90 | 1,12 | 1,08 |
CV (%) | 3,3 | 3,0 | 5,5 | 3,4 | 6,9 | 4,7 |
Kết quả phân tích cho thấy không có sự sai khác giữa các nền mẫu khác nhau (CV < 15 %), đạt yêu cầu US-FDA.
3.1.3.7. Xác định độ nhiễm chéo
Kết quả phân tích như sau