Đánh Giá Nghiên Cứu Tiền Công Thức

Độ đặc hiệu - chọn lọc của phương pháp

So sánh sắc ký đồ của 6 mẫu huyết tương trắng của 6 cá thể so với mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn MES ở nồng độ LLOQ (50 ng/ ml) và IS. Trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (có nồng độ MES tương ứng với nồng độ thấp nhất của đường chuẩn), các pic của MES và IS phải được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn với các pic tạp. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của MES không được vượt quá 20 % đáp ứng của MES ở nồng độ LLOQ. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được vượt quá 5 % đáp ứng của IS.

Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Pha 8 mẫu chuẩn MES có nồng độ khoảng từ 50 ng/ml đến 30000 ng/ml trong huyết tương. Phân tích theo quy trình đã xây dựng. Mỗi nồng độ phân tích 5 lần. Xác định sự tương quan giữa nồng độ MES (x) có trong mẫu và tỷ lệ diện tích pic MES/IS

(y) bằng phương pháp hồi quy tuyến tính, sử dụng hệ số tỷ trọng (1/x2). Đường chuẩn phải có hệ số tương quan r ≥ 0,95, độ đúng so với giá trị thực của nồng độ phải đạt từ 85 – 115 %, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ) cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80 - 120% và có ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và nồng độ cao nhất.

Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Phân tích các mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa chuẩn nội IS và chuẩn MES với nồng độ khoảng 50 ng/ml (mẫu LLOQ). Xác định nồng độ mesalamin có trong các mẫu LLOQ từ đường chuẩn tiến hành làm song song trong cùng điều kiện. Mẫu chuẩn có nồng độ MES thấp nhất của đường chuẩn được coi là LLOQ khi pic của MES được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn với các pic tạp; đáp ứng của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tại cùng thời gian lưu; độ đúng phải bằng 80 – 120 % so với nồng độ thực và độ chính xác khi tiến hành phân tích trên ít nhất 5 mẫu LLOQ độc lập phải ≤ 20 %.

Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 4 mức nồng độ khác nhau (LLOQ, LQC, MQC, HQC), có nồng độ tương ứng là 50; 150; 2000; 2400 ng/ml. Xác định hàm lượng MES có trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn và tỷ lệ %

giữa nồng độ xác định được từ đường chuẩn so với nồng độ lý thuyết. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu. Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV % giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ phân tích trong cùng một ngày. Xác định độ lặp lại khác ngày bằng cách tính toán độ lệch CV % giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau. Phương pháp đạt độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày khi độ đúng tại mỗi nồng độ nằm trong khoảng 85 – 115 %, trừ tại điểm LLOQ được chất nhận 80 – 120 %; độ lặp lại trong ngày có giá trị CV % ≤ 15 %; độ lặp lại giữa các ngày có giá trị CV ≤ 15 %. Riêng nồng độ LLOQ cho phép giá trị CV ≤ 20 %.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 299 trang tài liệu này.

Độ đúng, độ chính xác của phương pháp khi pha loãng

Chuẩn bị các mẫu AC1, AC2, AC3 có nồng độ tương ứng khoảng 300, 4000 và 48000 ng/ml. Tiến hành pha loãng 2 lần, xử lý và phân tích sắc ký các mẫu đó. Dựa theo đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện, xác định nồng độ MES có trong các mẫu pha loãng từ đó tính toán nồng độ MES có trong mẫu ban đầu. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu. Xác định độ chính xác bằng cách tính toán độ lệch CV % giữa giá trị các lần định lượng. Phương pháp đạt yêu cầu khi độ đúng nằm trong khoảng từ 85

- 115% so với giá trị thực và giá trị CV ≤ 15 %.

Tỷ lệ thu hồi

Tỉ lệ thu hồi IS: Tiến hành xử lý 6 mẫu huyết tương trắng có chứa chuẩn nội (nồng độ 700ng/mL) theo qui trình đã lựa chọn. Phân tích, xác định diện tích pic IS. Song song xác định diện tích pic IS của 6 mẫu chuẩn nội pha trong methanol - H2O (50:50) có nồng độ tương ứng. Tiến hành sắc ký, xác định tỷ lệ thu hồi IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của IS trong các mẫu QC có qua chiết tách – với đáp ứng của IS trong mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua chiết tách).

Tỉ lệ thu hồi MES: Chuẩn bị 6 mẫu ở mỗi nồng độ LQC, MQC, HQC pha trong huyết tương và pha trong methanol – nước (50:50). Xử lý các mẫu theo phương pháp đã xây dựng. Tiến hành sắc ký, xác định tỷ lệ thu hồi MES bằng cách so sánh kết

quả đáp ứng của MES trong các mẫu QC có qua chiết tách – với đáp ứng của MES trong mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua chiết tách).

Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi hoạt chất không quá 110 % và không thấp hơn 30 %; giá trị CV % giữa các đáp ứng của MES, IS trong các mẫu QC có qua chiết tách ở mỗi nồng độ ≤ 15 %; giá trị CV % giữa các đáp ứng của MES, IS trong các mẫu QC không qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 10 %; tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ của MES không khác nhau quá  15%.

Ảnh hưởng của nền mẫu

Chuẩn bị 6 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau, tiến hành xử lý theo qui trình thu được dung dịch nền mẫu. Chuẩn bị các mẫu chuẩn ở nồng độ LQC và HQC trong các dung dịch nền mẫu tương ứng. Song song chuẩn bị các mẫu chuẩn ở nồng độ LQC và HQC trong dung môi methanol – nước (50:50). Phân tích sắc ký các mẫu trên. Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic. Hệ số ảnh hưởng của nền mẫu MF của MES (hoặc IS) được xác định bằng tỷ lệ đáp ứng pic của MES (hoặc IS) trong dung dịch nền mẫu so với trong dung môi methanol – nước (50:50). Phương pháp đạt yêu cầu khi giá trị MF của MES và IS phải nằm trong khoảng giá trị 0,85 – 1,15; giá trị CV của tỷ số MFMES/MFIS ≤ 15 %

Độ nhiễm chéo

Chuẩn bị 06 mẫu huyết tương trắng, 06 mẫu chuẩn pha trong huyết tương ở nồng độ LLOQ, 06 mẫu chuẩn pha trong huyết tương ở nồng độ ULOQ. Tiêm sắc ký 06 mẫu LLOQ và tiêm xen kẽ mẫu blank sau mẫu ULOQ. Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic. Phương pháp đạt độ nhiễm chéo khi đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của MES không được vượt quá 20% đáp ứng của mẫu LLOQ; đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được vượt quá 5% đáp ứng của mẫu LLOQ.

Độ ổn định của hoạt chất trong huyết tương

Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã: Khảo sát độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -25º C và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau 3 chu kỳ đông – rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ MESA có trong mẫu. So sánh với kết quả xác định nồng độ MES

có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu). Nồng độ MES trong mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị CV % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.

Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn: Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng sau một thời gian nhất định, so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông. Nồng độ MES trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15 % và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.

Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler): So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong auto-sampler sau một thời gian nhất định và nồng độ của mẫu tiêm ngay sau xử lý. Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định trong auto-sampler sai khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.

Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài: Khoảng thời gian thử nghiệm độ ổn định dài ngày tối thiểu phải đủ để tiến hành lấy mẫu máu và phân tích hết số mẫu huyết tương của chó thử nghiệm. Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -25 ± 5ºC, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định. So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu. Nồng độ MES trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị CV % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15 %.

2.2.4.2. Đánh giá nghiên cứu tiền công thức

Tính chất

Quan sát bằng mắt thường màu sắc của dung dịch hoặc khối bột

Hàm lượng mesalamin

Được tiến hành tương tự phương pháp định lượng mesalamin trong pellet nhân

2.2.4.3. Đánh giá pellet nhân

Đánh giá hình thức bên ngoài

Quan sát bằng mắt thường pellet nhân phải nguyên vẹn, có màu đồng nhất, hình cầu và không bị dính vào nhau.

Hiệu suất bào chế pellet nhân

Hiệu suất bào chế pellet nhân được tính theo công thức sau:

Trong đó:

H% =

x 100%

- m: Khối lượng pellet thu được có kích thước 0,8 – 1 mm

- M: Khối lượng nguyên liệu rắn ban đầu (trừ dung môi hòa tan)

Độ trơn chảy

Xác định trên máy (ERWEKA GWF) đo tốc độ trơn chảy của hạt và bột với đường kính lỗ phễu 9 mm. Khối lượng pellet sử dụng cho mỗi lần đo là 100 g. Độ trơn chảy được tính theo công thức: v = tgα. Trong đó, v là tốc độ trơn chảy (g/giây); α là góc giữa đường thẳng biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng pellet chảy theo thời gian và trục hoành (trục thời gian).

Mất khối lượng do làm khô

Mất khối lượng do làm khô của pellet được xác định theo phương pháp mất khối lượng do làm khô trên cân xác định độ ẩm nhanh Sartorius MA 30. Cân khoảng 5 g pellet, nghiền mịn, cho 1 g vào đĩa cân, đặt nhiệt độ 105 oC ở chế độ tự động, theo dõi và đọc kết quả

Định lượng mesalamin trong pellet nhân

Pha mẫu thử: cân lượng chế phẩm tương đương khoảng 400 mg mesalamin, hòa tan trong 50 ml acid hydroclorid 1 N và pha loãng với nước đến nồng độ 0,2 mg/ml. Lọc qua màng lỗ xốp 0,45 mm được mẫu thử.

Tiến hành định lượng bằng phương pháp HPLC với các điều kiện đã được thẩm định (mục 2.2.4.1)

Tính phần trăm (g/100g) hàm lượng mesalamin (C7H7NO3) có trong mẫu theo công thức:

𝑅𝑢 𝑥 𝑚𝑠 𝑥 𝑃𝑠% 𝑥 (1 − 𝐴𝑠%)𝑥 𝑉𝑢 𝑥 𝑀𝑣

𝑅𝑠 𝑥 𝑚𝑢 𝑥 𝑉𝑠 𝑥 500

- Ru/Rs: Diện tích pic mesalamin dung dịch thử, dung dịch chuẩn

- Ps/As: Hàm lượng, độ ẩm chuẩn

- mu/ms: Khối lượng cân thử, chuẩn (mg)

- Vu/Vs: Hệ số pha loãng dung dịch thử, chuẩn

- Mv: Khối lượng trung bình pellet chứa 500 mg mesalamin (mg)

Đánh giá độ hòa tan in vitro của pellet nhân

Độ hòa tan mesalamin từ pellet nhân được đánh giá bằng thiết bị thử hòa tan Erweka với các thông số sau :

- Thiết bị cánh khuấy, tốc độ khuấy 50 vòng/phút

- Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 ± 0,5 oC

- Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8

- Cân một lượng chế phẩm tương đương 500 mg mesalamin cho vào cốc thử độ hòa tan.

- Thời điểm lấy mẫu: Lấy 10ml mẫu ở các thời điểm 1; 2; 3; 4 và 5 giờ, lọc và pha loãng với môi trường hòa tan nếu cần. Bổ sung 10 ml môi trường hòa tan sau khi lấy mẫu.

Pha dung dịch chuẩn nồng độ 0,025 mg/ml trong môi trường hòa tan. Tính lượng mesalamin đã hòa tan bằng cách so sánh độ hấp thụ UV của dung dịch thử và chuẩn trong môi trường pH 6,8 tại bước sóng 330 nm theo công thức



n1 

n Vm Vl Ci 

Trong đó:

X i1 100 + X

n P

Xn : % lượng hoạt chất giải phóng tại thời điểm thứ n

Cn : Nồng độ hoạt chất định lượng được tại thời điểm lấy mẫu thứ n (mg/ml)

Ci: Nồng độ hoạt chất định lượng được của mẫu lấy tại các thời điểm trước thời điểm thứ n

Vm : Thể tích môi trường hòa tan (ml)

Vl : Thể tích lấy mẫu (ml)

P : Hàm lượng hoạt chất theo nhãn

X: % lượng hoạt chất giải phóng trong môi trường ở giai đoạn trước

2.2.4.4. Đánh giá pellet bao

Tính chất

Quan sát bằng mắt thường pellet sau khi bao film phải nguyên vẹn, có màu đồng nhất, hình cầu và không bị dính vào nhau.

Bề dày màng bao

Được xác định gián tiếp dựa trên “Tỉ lệ khối lượng lớp vỏ bao” (TLVB), được tính theo công thức:

Trong đó:

𝑇𝐿𝑉𝐵 = (

𝑚2 − 𝑚1

𝑚1

) 𝑥100%

- m1 : Khối lượng pellet trước khi bao (g)

- m2 : Khối lượng pellet sau khi bao (g)

Định lượng mesalamin trong pellet bao

Phương pháp định lượng mesalamin trong pellet bao film được tiến hành giống như định lượng mesalamin trong pellet nhân

Đánh giá độ hòa tan in vitro của pellet bao

Vì màng bao pellet sử dụng Eudragit S100 có độ tan phụ thuộc pH (tan ở pH

> 7), do đó độ hòa tan in vitro được đánh giá ở 2 điều kiện bằng thiết bị thử hòa tan Erweka :

- Điều kiện 1 [86]

+ Thiết bị cánh khuấy, tốc độ 50 vòng/phút.

+ Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 ± 0,5 oC

+Môi trường thử hòa tan: 900 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 N (pH 1,2) và đệm phosphat pH 6,8.

+ Cân một lượng chế phẩm tương đương 500 mg mesalamin cho vào cốc thử độ hòa tan, thử ở môi trường pH 1,2 trong 2 giờ, sau đó thay chất

lỏng trong cốc bằng dung dịch đệm pH 6,8 và thử trong các giờ tiếp theo.

+ Thời điểm lấy mẫu: Hút 10 ml sau 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7 và 8 giờ, lọc và pha loãng với môi trường hòa tan nếu cần. Bổ sung 10 ml môi trường hòa tan sau khi lấy mẫu

- Điều kiện 2 [104], [89]

+ Thiết bị cánh khuấy, tốc độ 50 vòng/phút.

+ Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 ± 0,5 oC

+ Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 N (pH 1,2), đệm phosphat pH 7,4 và đệm phosphat pH 6,8.

+ Cân một lượng chế phẩm tương đương 500 mg mesalamin cho vào cốc thử độ hòa tan, thử ở môi trường pH 1,2 trong 2 giờ, sau đó thay chất lỏng trong cốc bằng dung dịch đệm phosphat pH 7,4, sau 3 giờ thử ở môi trường này, thay chất lỏng trong cốc bằng dung dịch đệm pH 6,8 và thử trong các giờ tiếp theo.

+ Thời điểm lấy mẫu: Hút 10 ml sau 2; 3; 4; 5; 7; 9 và 11 giờ, lọc và pha loãng với môi trường hòa tan nếu cần. Bổ sung 10 ml môi trường hòa tan sau khi lấy mẫu.

Pha dung dịch chuẩn nồng độ 0,025 mg/ml trong môi trường hòa tan. Tính lượng mesalamin giải phóng bằng cách so sánh độ hấp thụ UV của dung dịch thử và chuẩn trong môi trường pH 1,2 tại bước sóng 301 nm; pH 6,8 và pH 7,4 tại bước sóng 330 nm theo công thức



n1 

n Vm Vl Ci 

Trong đó:

X i1 100 + X

n P

Xn : % lượng hoạt chất giải phóng tại thời điểm thứ n

Cn : Nồng độ hoạt chất định lượng được tại thời điểm lấy mẫu thứ n (mg/ml)

Ci: Nồng độ hoạt chất định lượng được của mẫu lấy tại các thời điểm trước thời điểm thứ n