Độ Ổn Định Của Mes Huyết Tương Trong Các Điều Kiện Khác Nhau (N=6)

Bảng 3.15. Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo

Mẫu trắng		Mẫu LLOQ		Tỉ lệ đáp ứng pic (%)		Kết luận
MES	IS	MES	IS	MES	IS	Kết luận
1	978	2442	10905	215362	9,0	1,1	Đạt
2	920	2000	11773	217615	7,8	0,9	Đạt
3	797	2386	11034	216102	7,2	1,1	Đạt
4	716	3218	10710	211882	6,7	1,5	Đạt
5	919	2672	11464	216146	8,0	1,2	Đạt
6	775	3442	11460	212952	6,8	1,6	Đạt

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 299 trang tài liệu này.

Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của MES đáp ứng của các mẫu trắng đều

< 20 % đáp ứng LLOQ và tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS đáp ứng của các mẫu trắng đều < 5% đáp ứng LLOQ. Như vậy, phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu về độ nhiễm chéo của một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học

3.1.3.7. Nghiên cứu độ ổn định của mẫu phân tích

Bảng 3.16. Độ ổn định của MES huyết tương trong các điều kiện khác nhau (n=6)

Độ ổn định

Mẫu	Nồng độ ban đầu (ng/ml)	Nồng độ sau bảo quản (ng/ml)	Tỷ lệ sai khác (%)
3 chu kỳ đông – rã đông	LQC	154,5	166,0	7,4
3 chu kỳ đông – rã đông	HQC	24273,5	25532,8	5,2
Độ ổn định thời gian ngắn (5 giờ, nhiệt độ phòng)	LQC	154,5	152,9	-1,1
Độ ổn định thời gian ngắn (5 giờ, nhiệt độ phòng)	HQC	24273,5	24423,1	0,6
Độ ổn định trong autosampler (24 giờ/4oC)	LQC	154,5	162,7	5,3
Độ ổn định trong autosampler (24 giờ/4oC)	HQC	24273,5	25866,3	6,6
Độ ổn định dài ngày (-25 ± 5oC, 30 ngày)	LQC	154,5	152,8	-1,1
Độ ổn định dài ngày (-25 ± 5oC, 30 ngày)	HQC	24273,5	25976,8	7,0

Nồng độ mesalamin trong các mẫu LQC và HQC bảo quản sau 3 chu kỳ đông

– rã đông, sau 5 giờ bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ bảo quản trong autosampler và sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ -25 ± 5oC so với nồng độ ban đầu khác nhau ≤ 15

%. Do đó, MES ổn định trong mẫu huyết tương ở các điều kiện trên, đáp ứng yêu cầu US-FDA.

Kết quả thẩm định độ đặc hiệu – chọn lọc, độ đúng, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, tỷ lệ thu hồi và nghiên cứu độ ổn định cho thấy, phương pháp đã được xây dựng đáp ứng các yêu cầu của một phương pháp phân tích dùng trong sinh học. Phương pháp có thể áp dụng định lượng mesalamin trong huyết tương chó trong nghiên cứu hấp thu in vivo các chế phẩm chứa mesalamin.

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TIỀN CÔNG THỨC

3.2.1. Nghiên cứu tính chất dược chất

3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu ổn định của mesalamin trong các điều kiện khác nhau

Pha chế mẫu nghiên cứu như bảng 3.17 và bảo quản ở điều kiện như trình bày ở mục 2.2.1.

Bảng 3.17. Công thức nghiên cứu sự phân hủy mesalamin trong nước, UV, nhiệt độ, pH

Thành phần

DC01	DC02	DC03	DC04	DC05
Dung dịch mesalamin 0,5 mg/ml (dung dịch 1)	25 ml	25 ml	25 ml	25 ml	25 ml
Nước	Vđ 50ml	-	-	-	-
Nước chiếu UV	-	Vđ 50ml	-	-	-
Nước ở 100 oC	-	-	Vđ 50ml	-	-
Dung dịch NaOH 0,2 N	-	-	-	Vđ 50ml	-
Dung dịch HCl 0,2N	-	-	-	-	Vđ 50ml

Tiến hành phân tích mẫu nghiên cứu được kết quả sau

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nước, UV, nhiệt độ, pH tới sự phân hủy mesalamin

Mẫu

Thay đổi màu sắc	Hàm lượng mesalamin (%)
DC01 (nước)	Không màu	98,63
DC02 (nước, chiếu UV)	Không màu	93,35
DC03 (nước ở 100 oC)	Không màu	99,27
DC04 (dung dịch NaOH 0,2 N)	Nâu	3,50
DC05 (dung dịch HCl 0,2 N)	Không màu	100,34

Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ phân hủy mesalamin phụ thuộc vào pH môi trường hòa tan. Mesalamin ổn định trong môi trường acid mạnh, nhưng bị phân hủy nhanh trong môi trường kiềm mạnh biến màu nâu. Hàm lượng dược chất trong dung dịch NaOH 0,1N chỉ còn 3,50 %, trong khi hàm lượng này là 100,34% trong dung dịch HCl 0,1N. Ngoài ra, tác nhân nước, UV, nhiệt độ cũng làm dược chất bị phân hủy, tuy nhiên sự phân hủy trong môi trường nước và nhiệt độ cao không nhiều như các tác nhân khác.

3.2.1.2. Kết quả nghiên cứu ổn định của mesalamin trong môi trường có tác nhân oxi và tác nhân chống oxi hóa như dinatri edetat, natri metabisulfit, vitamin C.

Pha chế các mẫu DC06, DC07, DC08 và DC09 như sau và tiến hành bảo quản ở trong điều kiện trình bày ở mục 2.2.1.

Bảng 3.19. Công thức nghiên cứu sự phân hủy mesalamin trong môi trường có tác nhân oxi hóa và tác nhân chống oxi hóa

Thành phần

DC06	DC07	DC08	DC09
Dung dịch mesalamin 0,5 mg/ml (pha trong H2O2 5 %) (dung dịch 2)	25 ml	25 ml	25 ml	25 ml
Natri metabisulfit	-	12,5 mg	-	-
Vitamin C	-	-	12,5 mg	-
EDTA	-	-	-	12,5 mg
Dung dịch H2O2 5% vừa đủ	50 ml	50 ml	50 ml	50 ml

Tiến hành phần tích mẫu nghiên cứu được kết quả như sau

Bảng 3.20. Kết quả phân tích sự phân hủy dược chất trong các môi trường (n=2)

Mẫu

Thay đổi màu sắc	Hàm lượng mesalamin (%)
DC06 (dung dịch H2O2 5%)	Nâu	95,82
DC07 (dung dịch H2O2 5 % -natri metabisulfit)	Nâu	94,37
DC08 (dung dịch H2O2 5 % - vitamin C)	Nâu	97,84
DC09 (dung dịch H2O2 5% -EDTA)	Nâu	94,79

Tác nhân oxi hóa H2O2 5 % làm tăng phân hủy dược chất. Sau 48 giờ, hàm lượng dược chất còn 95,82 %. Các chất chống oxi hóa như natri metabisulfit và dinatri EDTA không giúp hạn chế sự phân hủy dược chất trong dung dịch H2O2 5 %, tuy nhiên, mesalamin ổn định hơn trong dung dịch H2O2 5 % khi có mặt tác nhân chống oxi hóa acid ascorbic (vitamin C). Trong cùng điều kiện thí nghiệm, hàm lượng mesalamin trong công thức DC07 (chứa natri metabisulfit) và DC09 (chứa dinatri EDTA) lần lượt là 94,37 % và 94,79 %, trong khi với công thức DC08 (chứa acid ascorbic) là 97,84 %.

3.2.2. Kết quả nghiên cứu tương tác dược chất - tá dược

Pha chế các mẫu nghiên cứu như bảng 3.21 và bảo quản ở điều kiện đã trình bày ở mục 2.2.1.

Bảng 3.21. Các mẫu nghiên cứu tương tác dược chất, tá dược

STT

Thành phần	TT01	TT02	TT03	TT04	TT05
1	Mesalamin	1 g	1 g	1 g	1 g	1 g
2	Celulose vi tinh thể PH101	1 g	-	-	-	-
3	Lactose monohydrat	-	1 g	-	-	-
4	Natri starch glycolat (DST)	-	-	1 g
5	Polyvinyl pyrolidon (PVP K30)	-	-	-	1 g	-
6	Aerosil 200	-	-	-	-	1 g

Tiến hành phân tích các mẫu nghiên cứu được kết quả như sau

Bảng 3.22. Kết quả nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược

Mẫu

Hàm lượng (%)
Ban đầu (*)	1 tháng lão hóa cấp tốc	3 tháng lão hóa cấp tốc
TT01	100,01 %	99,12 %	100,54 %
TT02		101,15 %	100,49 %
TT03		100,68 %	100,06 %
TT04		98,95 %	99,88 %
TT05		100,09 %	99,83 %

(*) Hàm lượng ban đầu là hàm lượng nguyên liệu trong CoA của NSX nguyên liệu

Kết quả phân tích hàm lượng sau 1 tháng và 3 tháng lão hóa cấp tốc cho thấy hàm lượng dược chất thay đổi không đáng kể ở các mẫu nghiên cứu, chứng tỏ dược chất ổn định, không xảy ra tương tác, không làm giảm hàm lượng hoạt chất sau 3 tháng lão hóa cấp tốc. Như vậy, có thể sử dụng các tá dược này trong thành phần các công thức pellet mesalamin.

3.3. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC PELLET MESALAMIN GIẢI PHÓNG TẠI ĐẠI TRÀNG

3.3.1. Xây dựng công thức pellet nhân bằng phương pháp đùn - tạo cầu

Dựa vào nghiên cứu tiền công thức, các tá dược MCC PH 101, PVP K30 và Aerosil được sử dụng trong thành phần pellet nhân. Để khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tạo cầu pellet, bào chế các mẫu pellet theo công thức như bảng 3.23 với tổng khối lượng pellet nhân chứa 500 mg mesalamin là 1105 mg.

Bảng 3.23. Công thức khảo sát ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng tạo cầu của pellet nhân (Tính cho lượng pellet có chứa 500mg mesalamin)

STT

THÀNH PHẦN	CT1	CT2	CT3	CT4
1	Mesalamin (mg)	500	500	500	500
2	MCC PH 101 (mg)	500	500	500	400
5	PVP K30 (mg)	90	90	90	90
6	Aerosil 200 (mg)	15	15	15	15
7	Nước (g) (*)	0,4	0,5	0,6	0,65

(*) Bay hơi trong quá trình pha chế

Tiến hành bào chế pellet nhân CT1, CT2, CT3 và CT4 với lượng dược chất, tá dược cho cỡ mẻ 500 g như phụ lục 2.1 và đánh giá hình thức pellet, hiệu suất sau bào chế. Nhận thấy, CT1 và CT2 pellet có hình trụ tròn ở hai đầu, không đều. Ngược lại CT3 và CT4 pellet hình cầu, đều, tuy nhiên hiệu suất tạo pellet của CT4 đạt 85%, trong khi CT3 đạt 92,4%. Do đó, CT3 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tiến hành thử hòa tan CT3 ở điều kiện thử hòa tan cho pellet nhân (900 ml môi trường đệm phosphat pH 6,8) ở mục 2.2.4.3, thu được kết quả như sau

120

100

THỜI GIAN (GIỜ)

% MESALAMIN GIẢI PHÓNG

Hình 3.8. % dược chất giải phóng từ pellet nhân sử dụng CT3 (n = 6)

Dược chất giải phóng nhanh trong môi trường hòa tan. Sau 4 giờ có hơn 90 % dược chất giải phóng từ pellet nhân và sau 5 giờ dược chất giải phóng hoàn toàn. Pellet vẫn giữ nguyên hình dạng khi giải phóng hoàn toàn dược chất.

3.3.2. Xây dựng công thức pellet mesalamin bao giải phóng tại đại tràng

Tiêu chuẩn đánh giá thuốc giải phóng tại đại tràng dựa theo T10 và T80 tương ứng với thời gian 10 % và 80 % lượng dược chất được giải phóng. Trong đó T10 được xem là quan trọng nhất vì đây chính là thời gian tiềm tàng (Tlag) của hệ, đặc trưng cho thuốc giải phóng tại đại tràng [30]. Tham khảo % dược chất giải phóng từ vi cầu indomethacin giải phóng tại đại tràng của Sajeev Chandran và cộng sự, mục tiêu bào chế được pellet mesalamin có một lớp bao film giải phóng tại đại tràng có T10 từ 4 - 6 giờ và T80 nhỏ hơn 16 giờ [85].

3.3.2.1. Nghiên cứu màng bao chỉ chứa zein trong pellet bao giải phóng tại đại tràng

Theo các tài liệu tham khảo trước đó, zein là nguyên liệu tiềm năng và triển vọng trong bào chế viên bao kiểm soát giải phóng. Tuy nhiên, hiện nay chưa có nghiên cứu nào sử dụng đơn thành phần zein làm tá dược kiểm soát giải phóng trong bào chế pellet giải phóng tại đại tràng. Do vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành bao pellet mesalamin chỉ sử dụng zein với mong muốn pellet bao sẽ giải phóng tại đại tràng theo cơ chế ăn mòn.

Tiến hành bao pellet sử dụng zein với tỉ lệ các thành phần trong công thức trình bày trong bảng 3.24 cho pellet nhân được bào chế bằng CT3

Bảng 3.24. Công thức dịch bao chỉ chứa zein cho 50 g mẻ pellet nhân mesalamin

STT

Thành phần	CT8
1	Zein	12 g
2	DBP	2,4 g
3	Talc	2,4 g
4	Tween 80	0,8 g
5	Ethanol 80 % vđ	200 ml

CT8

0 1 2 3

THỜI GIAN (GIỜ)

% MESALAMIN GIẢI PHÓNG

Pellet sau khi bao được đánh giá thử hòa tan in vitro ở điều kiện 1 (2 giờ đầu trong môi trường HCl 0,1 N pH 1,2 và các giờ tiếp theo ở môi trường đệm phosphat pH 6,8) ở mục 2.2.4.4 được kết quả như sau

Hình 3.9. Kết quả thử hòa tan pellet bao film chứa zein (n = 6)

Với bề dày màng bao 20%, dược chất trong pellet bao giải phóng nhanh trong 2 giờ đầu (khoảng 80% dược chất giải phóng sau 2 giờ), do đó, không thể bào chế pellet bao giải phóng tại đại tràng mà chỉ sử dụng zein làm tá dược kiểm soát giải phóng.

3.3.2.2. Nghiên cứu phối hợp zein với các tá dược kiểm soát giải phóng khác trong thành phần lớp bao

Qua kết quả được trình bày trong mục 3.3.2.1, luận án quyết định tiến hành phối hợp zein với 1 tá dược kiểm soát giải phóng khác để tăng khả năng trì hoãn giải phóng cho pellet bao với mong muốn: zein là một protein khi được ion hóa mang điện tích dương, phối hợp với 1 tá dược khi ion hóa mang điện tích âm sẽ làm cho màng bao chắc chắn hơn.

Nghiên cứu ảnh hưởng của loại tá dược kiểm soát giải phóng kết hợp với zein

Tiến hành bao pellet nhân CT3 sử dụng zein kết hợp với một tá dược kiểm soát giải phóng khác với tỉ lệ các thành phần trong công thức trình bày trong bảng 3.25.

Bảng 3.25. Công thức dịch bao khảo sát ảnh hưởng của loại tá dược KSGP kết hợp với zein cho 50 g mẻ pellet nhân mesalamin

STT

Thành phần	CT9	CT10	CT11
1	Zein	8	8	8
2	Pectin	4	-	-
3	Acid stearic	-	4	-
5	Eudragit S100	-	-	4
6	DBP (20%)	2,4	2,4	2,4
7	Talc (20%)	2,4	2,4	2,4
8	Tween 80	0,8	0,8	0,8
9	Ethanol 80o vđ (ml)	200	200	200

100

CT9

CT10 CT11

THỜI GIAN (GIỜ)

% MESALAMIN GIẢI PHÓNG

Tiến hành thử hòa tan ở điều kiện 1 (2 giờ đầu trong môi trường HCl 0,1 N pH 1,2 và các giờ tiếp theo ở môi trường đệm phosphat pH 6,8) ở mục 2.2.4.4 thu được kết quả sau

Hình 3.10. Kết quả thử độ hòa tan của các mẫu pellet bào chế theo công thức màng bao chứa zein kết hợp với một polyme kiểm soát giải phóng khác (n = 6)