Thẩm Định Các Phương Pháp Định Lượng Mesalamin

Tiến hành thử hòa tan để xác định sự ảnh hưởng của biến độc lập và biến phụ thuộc là T10 (Y1) và T80 (Y2), sau đó xác định công thức màng bao tối ưu bằng phần mềm MODDE 12.0

2.2.4. Phương pháp đánh giá

2.2.4.1. Thẩm định các phương pháp định lượng mesalamin

Phương pháp UV-VIS

Tham khảo tài liệu [100], [101] và các kết quả thực nghiệm, quy trình phân tích được xác định như sau:

- Môi trường hòa tan

900 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 N, đệm phosphat pH 7,4 và đệm phosphat pH 6,8 được chuẩn bị như sau:

+ Môi trường acid hydrocloric 0,1 N: pha loãng 8,5 ml acid hydrocloric với nước vừa đủ 1000 ml.

+ Môi trường đệm phosphat pH 7,4: pha loãng 250 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M và 195,5 ml dung dịch natri hydroxyd 0,2 M với nước vừa đủ 1000 ml.

+ Môi trường đệm phosphat pH 6,8: pha loãng 250 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M và 112 ml dung dịch natri hydroxyd 0,2 M với nước vừa đủ 1000 ml.

- Chuẩn bị

+ Mẫu trắng: môi trường hòa tan

+ Mẫu placebo: chuẩn bị như mẫu thử nhưng không chứa hoạt chất

+ Mẫu chuẩn: Cân chính xác 27,8 mg chuẩn mesalamin vào bình 100 ml, thêm 30 ml môi trường hòa tan, siêu âm hòa tan, thêm môi trường hòa tan vừa đủ thể tích. Hút chính xác 2 ml dung dịch này cho vào bình định mức 20 ml, thêm môi trường hòa tan vừa đủ thể tích, trộn đều thu được dung dịch chuẩn.

+ Mẫu thử: sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan, lọc.

Pha loãng dịch lọc thu được (nếu cần) với môi trường hòa tan.

- Tiến hành

Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng cực đại 301 nm đối với môi trường hòa tan là dung dịch HCl 0,1 N pH 1,2; 330 nm đối với môi trường hòa tan pH 6,8 và 7,4.

- Phương pháp UV-VIS được thẩm định theo các chỉ tiêu sau [37]:

+ Tính đặc hiệu

Chuẩn bị các mẫu sau: Mẫu trắng là pha động; mẫu placebo là mẫu pellet bao gồm nhân pellet chứa các thành phần tá dược giống công thức CT7 ở bảng

3.27 (không chứa hoạt chất mesalamin) và màng bao pellet chứa các thành phần tá dược giống công thức tối ưu ở bảng 3.37. Mẫu placebo được bào chế theo quy trình bào chế pellet bao ở mục 2.2.2; mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình; mẫu chuẩn được chuẩn bị theo quy trình. Tiến hành đo quang mẫu trắng, mẫu placebo, mẫu chuẩn và mẫu thử. Phương pháp đạt tính đặc hiệu khi phổ mẫu thử phải trùng với phổ mẫu chuẩn hoặc có cực đại hấp thụ tương đương nhau; ảnh hưởng của mẫu placebo đến kết quả định lượng hòa tan phải ≤ 2,0

+ Tính tương thích hệ thống

Thực hiện trên mẫu chuẩn 100 % (từ phần thẩm định tính đặc hiệu). Đo độ hấp thụ 6 lần trên mẫu chuẩn. Tính độ lệch chuẩn tương đối độ hấp thụ của mẫu chuẩn. Yêu cầu: giá trị RSD của độ hấp thụ từ 6 lần đo mẫu chuẩn phải ≤ 2,0 %.

+ Tính tuyến tính

Chuẩn bị 6 mẫu tự tạo có chứa 1%, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % và 125 % lượng mesalamin so với nồng độ định lượng hòa tan (0,0278 mg/ml). Đo độ hấp thụ của các dung dịch trên ở bước sóng cực đại, sau đó xác định phương trình hồi qui tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ. Phương pháp đạt tính tuyến tính khi hệ số tương quan R ≥ 0,998.

+ Độ đúng

Chuẩn bị 4 mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn cần phân tích vào các mẫu giả dược. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 1%, 10%, 80 % và 125 % so với nồng độ định lượng. Tại

mỗi mức nồng độ, thực hiện 3 mẫu độc lập. Tiến hành phân tích mẫu theo quy trình phân tích. Độ đúng của phương pháp được xác định dựa theo công thức:

Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) = Lượng hoạt chất thu hồi

Lượng hoạt chất thêm vào

x 100%

Phương pháp đạt độ đúng khi tỉ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ từ 97,0 - 103,0 % và RSD tỉ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ ≤ 2,0 %.

+ Khoảng xác định:

Được suy ra từ kết quả độ đúng và tính tuyến tính (từ giá trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng).

+ Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian.

+ Độ lặp lại

Chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập. Xác định hàm lượng hòa tan dựa vào độ hấp thụ đo được của các dung dịch chuẩn, dung dịch thử ở bước sóng cực đại, mẫu trắng là môi trường hòa tan. Phương pháp đạt độ lặp lại khi giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu ≤ 2,0 %

+ Độ chính xác trung gian

Tiến hành như độ lặp lại nhưng trong 2 ngày khác nhau và thiết bị phân tích khác nhau. Phương pháp phân tích đạt độ chính xác trung gian khi hàm lượng mesalamin trong 6 mẫu thử trong một ngày và trong 12 mẫu thử trong hai ngày đều có RSD ≤ 2,0 %.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Thẩm định phương pháp định lượng mesalamin trong hỗn hợp bột dược chất

– tá dược, pellet nhân và pellet bao giải phóng tại đại tràng bằng phương pháp HPLC được thực hiện trên pellet bao. Tham khảo tài liệu [100] và các kết quả thực nghiệm, quy trình phân tích được xác định như sau:

- Pha động

Hòa tan 4,3 g natri 1-octanesulfonat trong 1 lít nước, điều chỉnh đến pH 2,15 bằng acid phosphoric, lọc qua màng lọc lỗ lọc 0,45 µm, khử khí.

- Điều kiện sắc ký:

Tiền cột: 2 cột L1 (4,6 mm x 3,0 cm; 10 µm) đặt giữa bơm và bộ phận tiêm mẫu. Cột: L1 (4,6 mm x 3,3 cm; 3 µm). Detector UV: Tại bước sóng 230 nm. Tốc độ dòng: 2 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

- Chuẩn bị

Dung dịch gốc tương thích hệ thống: Cân 20 mg acid 3-aminosalicylic và 20 mg chuẩn acid salicylic vào bình định mức 200 ml, thêm 50 ml acid hydroclorid 1 N, siêu âm hòa tan, thêm nước vừa đủ thể tích.

Dung dịch tương thích hệ thống: Hút 5 ml dung dịch gốc tương thích hệ thống cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước vừa đủ thể tích được dung dịch tương thích hệ thống.

Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn mesalamin vào bình 25 ml, thêm 5 ml acid hydroclorid 0,25 N, siêu âm hòa tan, thêm nước vừa đủ thể tích.

Dung dịch thử gốc: Cân một lượng chế phẩm tương đương 400 mg mesalamin vào bình định mức 500 ml, thêm 50 ml acid hydroclorid 1 N, siêu âm 10 phút, thêm nước vừa đủ, lắc đều, lọc.

Mẫu thử: Hút chính xác 25 ml dung dịch thử gốc vào bình định mức 100 ml, thêm nước vừa đủ, trộn đều và lọc qua màng lọc 0,5 µm.

Mẫu trắng: Pha động

Mẫu placebo: Là pellet bao chỉ chứa tá dược giống mẫu placebo của mục thẩm định phương pháp UV-VIS ở trên. Quy trình pha mẫu placebo giống mẫu thử.

Mẫu chuẩn: Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc và 5 ml dung dịch tương thích hệ thống vào bình định mức 50 ml, thêm nước vừa đủ, trộn đều và lọc qua màng lọc 0,5µm.

Tính tương thích hệ thống: tiêm dung dịch chuẩn, độ phân giải giữa mesalamine và salicylic acid hoặc 3-aminosalicylic acid không nhỏ hơn 2, hệ số đối xứng không lớn hơn 2; độ lệch chuẩn giữa các lần tiêm không lớn hơn 2,0 %.

- Tiến hành

Tiêm riêng rẽ 20 µl dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng của pic chính, Tính phần trăm hàm lượng mesalamin (C7H7NO3) theo công thức:

HL (%) = (ru/rs) x (Cs/Cu) x 100

Trong đó:

+ ru/rs: Diện tích pic mesalamin dung dịch thử, dung dịch chuẩn

+ Cs/Cu: Nồng độ mesalamin dung dịch chuẩn, dung dịch thử (mg/ml)

- Phương pháp HPLC được thẩm định theo các chỉ tiêu sau [37]:

+ Tính đặc hiệu

Chuẩn bị các mẫu sau: Mẫu trắng là pha động; mẫu placebo là các tá dược theo công thức bào chế; mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình; mẫu chuẩn được chuẩn bị theo quy trình. Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu placebo và mẫu trắng. Phương pháp đạt tính đặc hiệu khi sắc ký đồ mẫu thử có pic có thời gian lưu tương đương thời gian lưu của pic mesalamin trong dung dịch chuẩn, đồng thời mẫu giả dược và mẫu trắng không có pic trùng với pic trên.

+ Tính tương thích hệ thống

Thực hiện trên mẫu chuẩn 100 % từ phần thẩm định tính đặc hiệu. Tiến hành sắc ký (06 lần tiêm lặp lại), ghi lại sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết. Phương pháp đạt tính tương thích hệ thống khi độ lệch chuẩn tối đa được phép cho các lần tiêm lặp lại là 2

%. Ngoài ra, hệ thống phải đạt yêu cầu hệ số bất đối của pic phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤ 1,5).

+ Tính tuyến tính

Chuẩn bị các mẫu sau: 5 dung dịch chuẩn có nồng độ 50 %; 80 %; 100

%; 120 % và 150 % so với nồng độ định lượng.

Tiến hành chạy sắc ký mỗi dung dịch chuẩn 2 lần, ghi lại sắc ký đồ và giá trị diện tích pic. Xác định sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của các dung dịch. Thiết lập phương trình hồi quy và vẽ đường biểu diễn sự tương

quan giữa nồng độ và diện tích pic. Phương pháp đạt tính tuyến tính khi hệ số tương quan R ≥ 0,998.

+ Độ đúng

Chuẩn bị các mẫu sau: 3 mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn cần phân tích vào các mẫu giả dược. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80 %, 100 % và 120 % so với nồng độ định lượng. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện 03 mẫu độc lập. Tiến hành phân tích mẫu theo quy trình phân tích. Độ đúng của phương pháp được xác định dựa theo công thức:

Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) = Lượng hoạt chất thu hồi

Lượng hoạt chất thêm vào

x 100%

Phương pháp đạt độ đúng khi: Tỉ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ từ 98,0 - 102,0 % và RSD tỉ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ ≤ 2,0 %.

+ Khoảng xác định

Được suy ra từ kết quả độ đúng và tính tuyến tính (từ giá trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng).

+ Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian.

+ Độ lặp lại

Chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập. Tiến hành chạy sắc ký một lần mỗi mẫu, xác định diện tích pic, từ đó suy ra hàm lượng mesalamin trong mỗi mẫu. Phương pháp đạt độ lặp lại khi giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu ≤ 2,0 %

+ Độ chính xác trung gian

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS

Thẩm định phương pháp định lượng mesalamin trong huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS. Tham khảo tài liệu [51] và các kết quả thực nghiệm, phương pháp thẩm định được thực hiện như sau:

Điều kiện sắc ký:

Cột: ES industries spherisep C6 (150 mm x 4,6 mm x 5 µm). Pha động: Dung dịch A: Acid formic 0,1% trong methanol, dung dịch B: acid formic 0,1% trong nước. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Detector: LCMS-8040. Thể tích tiêm: 5 µl. Nhiệt độ autosampler: 4 oC.

Bảng 2.7. Chương trình chạy gradient dung môi pha động

Thời gian (phút)

Dung dịch A (%)	Dung dịch B (%)
0	10	90
2,5	20	80
5,0	90	10
8,5	90	10
8,6	10	90
12,0	10	90

Mesalamin	Diazepam
m/z ion ban đầu	153,9	284,9
Năng lượng phân mảnh ion	-21	-31
m/z ion tạo thành (ion con định lượng)	108,05	193,15
m/z ion tạo thành (ion con định tính)	80	222

Nồng độ (ng/mL)	V huyết tương trắng (µL)	V chuẩn gốc (µL)	V HQC (µL)	V MQC (µL)
LQC	150	740	-	-	60
MQC	2000	550	-	50	-
HQC	24000	976	24	-	-