Phân tích sơ bộ thành phần hóa học và chiết phân đoạn của rễ cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms trồng tại An Giang

Quy trình này sử dụng chủ yếu cho các hỗn hợp các chất tổng hợp. Các quy trình phân tích được sử dụng trong phân tích thành phần hóa học của các thực vật có thể kể là quy trình phân tích của Puri (Hungari), của Schreiber (Đức) và quy trình phân tích của I. Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) v.v…

Trong các quy trình trên, quy trình phân tích của I. Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) thường được dùng vì những ưu điểm của nó so với các quy trình khác. Nó xác định được nhiều nhóm hợp chất trong nguyên liệu thực vật, cách thực hiện không quá phức tạp và có thể tiến hành trong một khoảng thời gian ngắn, với một lượng nguyên liệu nhỏ (khoảng 5 - 25 g). Kết quả có thể cho một khái niệm về thành phần hóa thực vật của một dược liệu (ĐH Y Dược TPHCM, 2014).

2.3. Một số phương pháp chiết tách

Mục đích của việc tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên.

Khảo sát thành phần hóa học của một cây mới, trước đó chưa ai nghiên cứu và xem những chất này có hoạt tính sinh học. Muốn biết được điều này cần phải cô lập hợp chất đạt độ tinh khiết > 95 % mới có thể khảo sát cấu trúc hóa học bằng phương pháp quang phổ hiện đại.

Cần có thêm lượng mẫu một hợp chất đã biết cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm về hoạt tính sinh học của chất đó. Nếu việc thử nghiệm cho kết quả hấp dẫn thì sẽ xem xét có thể tổng hợp hóa học hợp chất đó để có số lượng nhiều hơn.

Tìm hiểu một hợp chất đã biết và xem chất này được sản sinh ra từ bộ phận nào của sinh vật.

Tìm hiểu sự khác biệt của những chất biến dưỡng thứ cấp được sản sinh ra từ cùng một nguồn tự nhiên nhưng không cùng điều kiện sinh thái: Thí dụ tìm hiểu xem hai thực vật cùng họ (family), cùng chi (genus), cùng loài (species) nhưng mọc ở hai nơi có điều kiện khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác nhau có chứa cùng những hợp chất tự nhiên và những chất này có cùng hàm lượng hay không.

Có nhiều phương pháp để tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên từ cây cỏ: Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký gel, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp hơn vì không biết được cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học như thế nào. Biết rằng cây cỏ cần khảo sát có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất phân cực, vì thế nếu muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn. Vì vậy, người ta thường chuẩn bị một loạt các cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết chứa tương đối ít

hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng. Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau”: Dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất. Tùy theo cơ chế và đặc điểm của quá trình chiết mà người ta phân ra:

- Chiết lỏng - lỏng (phân bố lỏng - lỏng) với cơ chế chính là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố.

- Chiết rắn - lỏng với cơ chế chính là sự hòa tan của chất tan vào dung môi.

Trong chiết rắn - lỏng, chất tan có thể đi vào dịch chiết bằng sự hòa tan đơn giản, nhưng cũng có thể chịu sự tác động bởi nhiều các quá trình khác như khi chiết các chất tan từ một Dược liệu.

Trong quá trình chiết thông thường, các tiểu phân chất rắn chịu tác động của dung môi trong điều kiện như nhau. Các chất tan hòa tan trong dung môi thành dung dịch và tạo nên dịch chiết, sự hòa tan này ít bị ảnh hưởng bởi các chất không tan. Trong quá trình chiết các chất từ các tổ chức sống (các mô tế bào động, thực vật và vi sinh vật), các chất nằm bên trong các tế bào, cách biệt với bên ngoài bởi vách tế bào, vì thế các chất tan sau khi hòa tan thành dung dịch còn phải vượt qua vách tế bào ra khỏi các mô để đi vào dịch chiết. Quá trình chiết các chất tan từ các tổ chức sinh học vì thế thường được gọi là quá trình “chiết xuất” (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi. Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với metanol 80 %, đuổi dung môi thu được alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ eter dầu hỏa…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo…), dung môi phân cực trung bình (thí dụ như dietyleter, chloroform…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức eter - O -, aldehyd - CH =

O, ceton - CO -,…) và dung môi phân cực mạnh (thí dụ metanol…) hòa tan các hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức - OH, - COOH …) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Nguyên tắc cơ bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K.

K = 𝐶𝑎

𝐶𝑏

Ca= Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng.

Cb= Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 106 trang tài liệu này.

Mục đích chính của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ, tinh chế hóa một hợp chất nào đó. Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này có hằng số phân bố tương đối lớn còn các chất tạp bẩn cũng như các chất khác thì có cấu trúc hóa học không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó.

Hằng số của chất tan tương đối ít thay đổi theo nhiệt độ hoặc nồng độ của chất tan đó có trong dung dịch ban đầu, tuy nhiên hằng số này thay đổi nhiều tùy thuộc vào dung môi (độ phân cực, đặc tính ái nước của dung môi) và dung dịch nước. Riêng với dung dịch nước, pH của dung dịch có những ảnh hưởng rất quan trọng, nhất là ở pH acid yếu và ở pH base yếu.

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước. Sử dụng các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau. Và còn tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hay ở lớp dưới so với pha nước.

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi hữu cơ phân cực hơn thí dụ như: Ether dầu hỏa hoặc hexan, ether etyl, chloroform, ethyl acetat, n-butanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến không còn chất hòa tan vào dung môi thì chuyển sang chiết với dung môi có độ phân cực cao hơn. Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan với nước như: Na2SO4, MgSO4, CaSO4,…, loại dung môi (bằng cách cô thu hồi dung môi) và cuối cùng là thu được cao chiết.

Muốn kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn ở lại trong pha nước….thì ta có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng (SKLM);

trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và pha hữu cơ. Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ. Song song đó, chúng ta cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên một tấm kiếng sạch, sau khi đuổi bay hết dung môi, thì giọt dung dịch lần thứ n đó không còn để lại vết nào trên tấm kiếng đó.

Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng - lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi cũng sẽ tăng lên và những nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều sự thay đổi.

Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên ở những lần chiết sau, dung môi trong bình lóng sẽ tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp. Để khắc phục nhược điểm này, có thể sử dụng các cách như: dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào bình chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ bọt khí; muối NaCl làm giảm sự hòa tan vào nhau giữa acetonitril và nước, một lượng tối thiểu khoảng 20 g NaCl được cho vào một lít dung dịch gồm acetonitril: nước (1 : 1) sẽ làm dung dịch này tách thành 2 lớp; độ hòa tan của một vài hợp chất thay đổi đáng kể khi có sự hiện diện của nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.2. Kỹ thuật chiết rắn - lỏng

Một số phương pháp chiết rắn - lỏng:

- Kỹ thuật chiết ngấm kiệt.

- Kỹ thuật chiết ngâm dầm.

- Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet.

- Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Kumagawa.

- Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước.

- Chiết các nguyên liệu tươi.

- Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn.

Kỹ thuật chiết ngấm kiệt.

Ngấm kiệt là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi dịch chiết đi từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn.

Do quá trình chiết xảy ra theo gradient nồng độ nên quá trình chiết xảy ra triệt để hơn, lượng dung môi sử dụng ít hơn phương pháp ngâm và dược liệu được chiết kiệt hơn.

Các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, chất diện hoạt v.v… có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết.

Quá trình ngấm kiệt được thực hiện trong bình chiết được gọi là bình ngấm kiệt. Hình dạng, cấu tạo và kích thước của bình ngấm kiệt có thể thay đổi tùy theo mục đích sử dụng nhưng thông thường phần thân chính của bình ngấm kiệt có dạng hình nón cụt có thể kín và có van điều chỉnh lưu lượng ở một đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh ở cả hai đầu.

Quá trình ngấm kiệt có thể được tiến hành dưới nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Bình được thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệt độ cao. Chú ý: Khi ngấm kiệt ở nhiệt độ cao có thể làm tăng tốc độ chiết nhưng có thể dẫn đến phân hủy chất dễ chuyển hóa bởi nhiệt.

Có thể thực hiện ngấm kiệt và rút kiệt dịch chiết trên từng bình ngấm kiệt riêng lẻ hay kết hợp nhiều bình ngấm kiệt nối tiếp với nhau (ngấm kiệt ngược dòng). Trong ngấm kiệt ngược dòng, hệ thống được bố trí sao cho dịch chiết loãng của bình chiết trước sẽ là dung môi đầu cho bình chiết sau và mỗi bình chỉ lấy ra một lượng dịch chiết đậm đặc nhất định. Với ngấm kiệt ngược dòng, lượng dịch chiết thu được từ mỗi bình luôn nhỏ hơn nhiều và có nồng độ cao nhất so với ngấm kiệt từng bình riêng lẻ mà vẫn đảm bảo chiết kiệt Dược liệu.

Có 3 phương pháp ngấm kiệt:

- Ngấm kiệt thường.

- Ngấm kiệt kèm sấy phun.

- Ngấm kiệt ngược dòng.

Ngấm kiệt thường là phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp.

- Dụng cụ:

Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, inox, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết.

- Tiến hành:

Dược liệu được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm. Mẫu không nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, mẫu được xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy nhựa hoặc có thể trương nở… sẽ cản trở dòng chảy.

Bột dược liệu được làm ẩm với một lượng dung môi chiết với một lượng vừa đủ để trong khoảng 4 giờ.

Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ. Đậy bề mặt lớp bột đã làm ẩm bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp trên lớp mặt. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội.

Để yên sau một thời gian, thường là 12 - 24 giờ, mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này.

Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là đã chiết kiệt (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi thời điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút ra khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong Dược liệu.

Sự khuấy trộn, các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm, vi sóng, chất diện hoạt v.v… có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Phương pháp ngâm lạnh

Trong phương pháp ngâm lạnh, dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm bình thường không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được căn bản hoàn tất. Trong thời gian này, cân bằng về nồng độ hoạt chất giữa bên trong và bên ngoài thành tế bào được thiết lập và quá trình thẩm thấu sẽ kết thúc. Thời gian ngâm có thể kéo dài hơn, từ một đến nhiều ngày, tùy theo Dược liệu, loại dung môi và yêu cầu chiết xuất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Phương pháp ngâm nóng

Phương pháp ngâm nóng là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn ở nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi.

Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn.

Quá trình hãm trong y học cổ truyền và trong cuộc sống hằng ngày (hãm thuốc, hãm trà) chính là quá trình ngâm nóng với dung môi là nước. Chưng cũng có thể coi là một biến thể của phương pháp này (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa

Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần với một lượng nhỏ dung môi. Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet thực ra gần với phương pháp ngâm lạnh hơn.

Túi đựng bột dược liệu của kỹ thuật Kumagawa gần nguồn nhiệt hơn. Chiết hồi lưu với quy mô nhỏ.

Dụng cụ gồm 3 phần chính.

- Bình cầu đun có điều nhiệt.

- Thân Soxhlet.

- Bộ sinh hàn.

Dịch chiết sẽ được thu tại bình cầu đun. Thời gian chiết 12 – 24 – 36 giờ.

Ưu điểm:

Lượng dung môi sử dụng nhỏ mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất.

Nhược điểm:

Khó thực hiện cho một lượng lớn Dược liệu. Thông thường, chỉ dùng để chiết trong phòng thí nghiệm hoặc quy mô pilot.

Không khấy trộn được trong quá trình chiết xuất.

Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước.

Kỹ thuật đặc trưng để chiết ra khỏi cây cỏ các loại hợp chất có tính bay hơi được, ví dụ như tinh dầu.

Chiết các nguyên liệu tươi

Với các mô sống của động vật hay các dược liệu mỏng manh như lá, hoa người ta có thể chiết nhanh các chất trong tế bào với các dung môi nước hoặc thân nước bằng cách xay nhỏ mô động thực vật trong dung môi.

Nguyên liệu được cắt nhỏ, ngâm ngập trong dung môi và được xay nhỏ bằng một cánh khuấy quay với tốc độ rất cao (khoảng 10,000 vòng/ phút) trong một thời gian ngắn khoảng 5 - 10 phút. Với tốc dộ này, các mô được phân tán rất nhỏ, tế bào bị vỡ và các chất tan đi thẳng từ dịch tế bào vào dịch chiết chủ yếu bằng quá trình hòa tan. Sự thẩm thấu, nếu có cũng chỉ đóng vai trò thứ yếu.

Với cách chiết này, toàn bộ các chất trong tế bào gồm cả các chất chuyển hóa bậc II lẫn các chất đại phân tử đều có mặt trong dịch chiết. Cách chiết này có lợi khi nghiên cứu các protein, các chất mà hoạt tính sinh học phụ thuộc vào cấu trúc lập thể thứ các của phân tử. Trong nghiên cứu Dược liệu, để hạn chế hoạt động của các enzym có thể làm thay đổi cấu trúc các chất và hạn chế các tạp chất như protein, polysaccharid, dung môi sử dụng có thể là cồn hay aceton.

Quá trình chiết này do được thực hiện bằng máy khuấy có tốc độ cao nên cũng được gọi là turbo - extraction (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Các phương pháp chiết khác

Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, trong thực tế người ta còn dùng các kỹ thuật hỗ trợ khác để đẩy nhanh quá trình hòa tan như chiết xuất sử dụng siêu âm, chiết xuất sử dụng vi sóng, chiết dưới áp suất hay sử dụng các dung môi đặc biệt để chiết như chiết chất lỏng siêu tới hạn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).