Phương Pháp Phân Lập, Xác Định Cấu Trúc Hóa Học Của Các Hợp Chất Từ Rễ

Singapore, Malaysia.v.v... [75].

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về mật nhân đã công bố tương đối nhiều, kết quả được thực hiện trên nhiều nguồn nguyên liệu trên cả nước. Tuy nhiên, đa phần là những nghiên cứu quy mô nhỏ, dưới dạng các bài báo khoa học chuyên ngành, chưa có nghiên cứu nào mang tính hệ thống và tính định hướng từ khảo sát nguyên liệu, chiết tách, thăm dò hoạt tính sinh học và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt đối với mật nhân tại khu vực miền Trung và Tây Nguyên, mặc dù thực tế, rễ cây mật nhân được bày bán khá phổ biến, đặc biệt là ở Quảng Nam, Huế và Gia Lai. Bên cạnh đó, trên thị trường đã có một số sản phẩm dược phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ loài cây này, tuy nhiên, hiện chưa nhiều các sản phẩm ứng dụng mật nhân được sản xuất và kinh doanh mang tính thị hiếu vừa có tác dụng hỗ trợ sức khỏe, vừa có chức năng giải khát.

Chính vì vậy, với mong muốn bảo tồn và sử dụng nguồn gen quý cây mật nhân tại Tây Nguyên, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn dữ liệu về loại thảo dược tại v ng này, đa dạng sản phẩm thực phẩm có tính ứng dụng, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia jack) ở khu vực miền Trung - Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm với những nội dung nghiên cứu cụ thể sau:

- Khảo sát khả năng kháng độc tế bào ung thư, kháng oxy hóa của dịch chiết rễ cây mật nhân ở huyện Phước Sơn - tỉnh Quảng Nam và huyện Ia Grai - tỉnh Gia Lai nhằm đánh giá, lựa chọn nguồn nguyên liệu rễ cây mật nhân phục vụ nghiên cứu.

- Phân lập các hợp chất từ các cao chiết dung môi phân cực, phân cực trung bình và ít phân cực Định danh các hợp chất đã phân lập, xác định thành phần, cấu trúc hóa học của các hợp chất thuộc nhóm alkaloid và những hợp chất không thuộc nhóm alkaloid.

- Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng quy trình chiết trong dung môi nước và ethanol 80 % để xây dựng các quy trình chiết tách, từ đó, sản xuất cao chiết mật nhân và bột mật nhân để bổ sung vào quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

- Thăm dò hoạt tính kháng độc tế bào ung thư, kháng viêm, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng oxy hóa, thử độc tính bất thường, khả năng gây độc tế bào người của dịch chiết rễ cây mật nhân.

- Ứng dụng mật nhân để sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, đánh giá cảm quan, đánh giá an toàn vệ sinh thực phẩm và công bố chất lượng các sản phẩm.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 151 trang tài liệu này.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Thu hái và định danh mẫu rễ cây mật nhân

Mẫu rễ cây mật nhân được thu hái tại v ng đồi núi tỉnh Gia Lai và Quảng Nam, các vùng này có rất nhiều loại cây dược liệu có giá trị.

Phương pháp lấy mẫu thực vật: Rễ cây mật nhân được thu hái và lấy mẫu để nghiên cứu theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8551:2010 – Cây trồng – Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu.

Rễ cây mật nhân được định danh tại phòng sinh học và được lưu trữ mẫu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam.

2.1.2. Xử lý nguyên liệu

Rễ cây mật nhân được xử lý loại bỏ tạp chất, bụi bẩn, rửa rồi phơi khô, sau khi phơi khô có m i thơm đặc trưng Tiến hành chẻ nhỏ thành lát mỏng rồi sấy ở nhiệt độ 60 oC trong 24 giờ, độ ẩm khoảng (10 ÷ 12) %, xay nhỏ dạng bột với kích thước từ (0,5 ÷ 1) cm, đóng gói, bảo quản ở điều kiện thường trong phòng thí nghiệm để đưa vào nghiên cứu [83].

a. Chưa qua xử l b Sau khi cắt nhỏ c Bột rễ mật nhân

Hình 2.1. Một số hình ảnh của rễ mật nhân

Nguyên liệu chính sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Cỏ ngọt, la hán quả và cam thảo khô được mua tại nhà thuốc Đông y tại thành phố Đà Nẵng. Nụ vối được thu hái tại v ng đất trồng ở Tràng An, Ninh Bình và được phơi khô Rau má được mua tại siêu thị ở Đà Nẵng.

2.2. Hóa chất, vật tư, thiết bị, dụng cụ

2.2.1. Hóa chất, vật tư

Một số hóa chất, vật tư chính d ng trong nghiên cứu như sau:

- Ethanol, xuất xứ: Việt Nam, độ tinh khiết: 96%

- Methanol, xuất xứ: Đức, độ tinh khiết: 99,9%

- n-Hexane, xuất xứ: Đức, độ tinh khiết: 99,9%

- Ethyl acetate, xuất xứ: Đức, độ tinh khiết: 99,9%

- Maltodextrin, xuất xứ: Trung Quốc, DE từ 10 ÷ 15

- Đường tinh luyện, xuất xứ: Việt Nam, độ tinh khiết: 99,8%, độ màu ≤ 20 Icumsa.

- Pectin, xuất xứ: Đức, HMP, DE > 50%, MI > 7%, DA = 0

Một số hóa chất, vật tư khác d ng trong nghiên cứu được nêu ở Phụ lục 1.

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu như sau:

- Cân phân tích, d = 0,0001 g (Model: TDX-A300, Marcus, Đức ;

- Tủ sấy Model: UNB-400, Memmert, Đức ;

- Sắc k lớp mỏng: Bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel Meck 60 F254, dày 0,2 mm Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng = 254 nm và 365 nm, thuốc thử hiện màu vanilin/H2SO4 (vanilin 1,2 g; MeOH 200 mL; CH3COOH 25 mL; H2SO4 11 mL);

- Sắc k cột thường: Silicagel cỡ hạt 197 – 400 mesh (0,040 mm – 0,063 mm) cho cột đầu, sắc k cột nhanh: Silicagel cỡ hạt 70 – 200 mesh, sắc k cột pha đảo: RP- 18, sắc k lọc gel: sephadex LH-20 Merck, nhựa Dianion HP-20.

- Thiết bị cô quay chân không Model: Hei-VAP precision, Heidolph, Đức ;

- Hệ thống sắc k lỏng hiệu năng cao HPLC Model: Hitachi, Nhật ;

Các thiết bị, dụng cụ khác được sử dụng trong nghiên cứu được nêu ở phụ lục 1.

2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Rễ cây mật nhân

Chiết phân đoạn

Tinh chế, làm sạch

Định danh, xác định cấu trúc

Dịch chiết nước

Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu

Phân lập, xác định thành phần, cấu trúc hóa học

Xây dựng quy trình chiết:

 Lựa chọn phương pháp chiết và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình chiết

 Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng quy trình chiết trong dung môi nước và ethanol 80 %

Dịch chiết ethanol 80 %

Thăm dò hoạt tính sinh học:

 Kháng tế bào ung thư, kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng sinh

Thử độc tính bất thường, độc tính với tế bào người

Sản xuất bột mật nhân

Trà thảo mộc mật nhân

Sản xuất cao chiết mật nhân

Nước rau má mật nhân

Bổ sung cao mật nhân Đánh giá cảm quan Đánh giá ATVSTP Công bố chất lượng

Đánh giá ATVSTP Công bố chất lượng

Bổ sung bột mật nhân Đánh giá cảm quan Đánh giá ATVSTP Công bố chất lượng

Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu

Rễ cây mật nhân được thu nhận từ vùng núi huyện Ia Grai - tỉnh Gia Lai và vùng núi huyện Phước Sơn - tỉnh Quảng Nam, nguyên liệu được khảo sát, đánh giá, lựa chọn nhằm sử dụng cho toàn bộ quá trình nghiên cứu. Rễ cây mật nhân được xử lý sơ bộ, xay nhỏ thành bột, sau đó, chiết trong các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau tạo thành dịch chiết để phân lập và định danh, xác định thành phần hóa học, cấu trúc hóa học của các hợp chất. Từ kết quả đó, chúng tôi nghiên cứu chọn hàm mục tiêu để tối ưu hóa các thông số nhằm xây dựng quy trình chiết. Ngoài ra, chúng tôi khảo sát hoạt tính sinh học các dịch chiết thu được để làm cơ sở cho quá trình ứng dụng bổ sung trong quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng ở mô phòng thí nghiệm, đánh giá chất lượng và an toàn thực phẩm của các sản phẩm thu được. Sản xuất cao chiết mật nhân và bột mật nhân để bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, đánh giá cảm quan, an toàn thực phẩm, thời gian bảo quản và công bố chất lượng sản phẩm.

2.4. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

2.4.1. Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu

Các tiêu chí được sử dụng để đánh giá, lựa chọn nguyên liệu bao gồm:

- Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học và các chỉ tiêu hóa l được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng với các phương pháp phân tích sau:

Phương pháp lấy mẫu thực vật: TCVN 8551:2010

Phương pháp xác định hàm lượng protein: TCVN 8125:2015

Phương pháp xác định hàm lượng lipit: TCVN 6555:2017

Phương pháp xác định hàm lượng xơ thô: TCVN 5103:1990

Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng: KT2 K2 TN-15/TP

Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng: AOAC 999 11

- Sàng lọc một số hoạt tính sinh học của dịch chiết như:

Thử khả năng kháng độc tế bào ung thư: Sử dụng phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp [29]. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện sinh học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

Thử khả năng kháng oxy hóa: Sử dụng phương pháp đánh giá thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết vì

điều kiện thực hiện thuận lợi và gần đây có nhiều tác giả đã chọn phương pháp này [35]. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trường đại học bách khoa – Đại học Đà Nẵng.

Từ kết quả nghiên cứu và sàng lọc, vùng nguyên liệu được lựa chọn để thu nhận rễ mật nhân nhằm thực hiện các công đoạn nghiên cứu tiếp theo.

2.4.2. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật nhân

2.4.2.1. Phân lập các hợp chất hóa học

a. Nhóm hợp chất alkaloid

Rễ mật nhân

Nước

Chưng ninh hồi lưu

+ Nhiệt độ: 70 oC

+ Thời gian: 120 phút

+ Tỷ lệ dung môi/

nguyên liệu: 20

Bã

Lọc

mL/1 g

Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt

độ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút

Cao chiết nước

Hình 2.3. Sơ đồ chưng cất tạo cao chiết nước

Cao chiết nước (40 g)

F8 (1,7 g)

(F8 + F9)

F3 (17 g)

(F3 + F7)

SKC silicagel, hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 9:1tăng dần đến 1:1), rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (1:1), thu được 15 nhóm phân đoạn

F8.1 ......F8.19

chọn F8.12 (200 mg)

F3.1 .......F3.15

chọn F3.6 (0,12 g)

F3.1 ....... F3.15

chọn F3.2 (1,2 g)

SKC Sephadex, rửa giải bằng MeOH, thu được 7 phân đoạn

SKC silicagel, hệ dung

môi DCM:MeOH

95:5 , thu được 4 phân đoạn

SKC silicagel, hệ dung

môi CH2Cl2:MeOH

95:5 tăng dần đến tỷ lệ 1:1 , thu được 14 phân đoạn

F8.12.1 ......F8.12.7

chọn F8.12.3

SKC

Sephadex (2 lần)

F3.6.1 ..... F3.6.4

chọn F3.6.2

SKC

Sephadex

F3.2.1 ......F3.2.14

chọn F3.2.12

SKC Sephadex (2 lần)

EL1B

(10 mg)

(trắng)

EL1C

(5 mg)

(trắng)

EL5

(6 mg)

(trắng)

EL4

(6 mg)

(vàng)

SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải 100% H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2);

MeOH:H2O (5:5) và MeOH 100%thu được 15 phân đoạn F1-F15)

SKC silicagel, hệ dung môi CH2Cl2:MeOH

98:2 tăng dần đến 1:1),

thu được 19 phân đoạn

Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất nhóm alkaloid

Tiến hành chưng ninh hồi lưu trong nước 4 kg bột rễ cây mật nhân ở nhiệt độ 70 oC trong 120 phút với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20 mL/g theo sơ đồ hình 2.3. Sau khi loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô quay chân không thu được 40 g cặn chiết nước. Cho 40 g cặn chiết nước qua hệ thống sắc ký cột với chất hấp phụ là Diaion đường kính cột d = 60 mm; chiều dài lớp Diaion l = 800 mm); hệ dung môi rửa giải 100% H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2); MeOH:H2O (5:5) và

MeOH 100 %, thu được 15 nhóm phân đoạn chính, ký hiệu từ F1 đến F15.