Định Tính Sơ Bộ Các Nhóm Chính Trong Thân Và Rễ Đinh Lăng

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

3.1.1. Nguyên liệu

- Mẫu cây tươi cả lá, thân, rễ Đinh lăng (Polyscias fruticosa(L.) Harms).

- Thân và rễ Đinh lăng dùng để nghiên cứu thành phần hóa học và chiết phân đoạn.

3.1.2. Hóa chất và dung môi

Ngoài một số dung môi hóa chất cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm, trong phần thực nghiệm có sử dụng:

- Hóa chất khảo sát vi học: Dung dịch javel 50 %, dung dịch acid acetic 1 %, dung dịch iod 0,1 % (son phèn), dung dịch carmin 1 %, nước cất.

- Dung môi chiết xuất: EtOH 96 %, MeOH.

- Dung môi dùng trong lắc phân bố, sắc ký lớp mỏng: Diethyl ether, ethyl acetat,

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 106 trang tài liệu này.

n-butanol.

- Dung môi sắc ký lớp mỏng: Chloroform, methanol, n-hexan, n-butanol, diethyl ether, ethyl acetat, petroleum ether, benzen.

- SKLM dùng bản silica gel F254 Merck tráng sẵn trên nền nhôm.

- Chất chuẩn: Acid oleanoid chuẩn.

- Phát hiện vết chất: Đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm, thuốc thử vanillin sulfuric (VS), thuốc thử acid sulfuric 10 %/EtOH.

3.1.3. Trang thiết bị

- Bếp cách thủy.

- Bình sắc ký Tây Ban Nha.

- Cân phân tích OHAUS PAJ 2102.

- Cân phân tích 4 số.

- Đèn UV 254 và 365 nm.

- Điện thoại di động SAMSUNG J7 Prime.

- Kính hiển vi OLYMPUS CX22.

- Máy cô quay Shendi RE-52CS-1.

- Máy khuấy EMCLAB OS20-Pro.

- Tủ lạnh SANYO.

- Tủ sấy DRYING OVEN.

- Các dụng cụ thông dụng khác trong phòng thí nghiệm.

3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1. Thu hái xử lý và bảo quản Đinh lăng

3.2.1.1. Thu hái

Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) được thu hái ngày 11/11/2016 tại Tri Tôn - An Giang, dược liệu thu hái về được PGS.TS. Trần Công Luận định danh và so sánh với các tài liệu tham khảo xác định được là đúng loài Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) (Đỗ Tất Lợi, 2004; Vò Văn Chi, 2012).

3.2.1.2. Xử lý và bảo quản

Để khảo sát cây khô thì rễ tươi và thân tươi sau khi thu hái được làm sạch và phơi khô ở nhiệt độ phòng hoặc sấy trong tủ sấy ở 60 - 80 oC, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời gay gắt vì tia tử ngoại (UV) có trong ánh sáng mặt trời có thể kích thích phản ứng hóa học, tạo nên các hợp chất giả tạo. Tiến hành xay thành bột dược liệu để sử dụng cho nghiên cứu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM, 2014).

Để khảo sát cây tươi (khảo sát về đặc điểm vi học), Đinh lăng sau khi được thu hái, làm sạch thì đem đi khảo sát ngay, tránh để trong thời gian lâu vì sẽ làm mất các tế bào hay các tế bào sẽ không còn nguyên vẹn,.. chọn mẫu phải chính xác, có tính đại diện, không quá già không quá non (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM, 2014).

Lưu trữ mẫu: Mẫu được lưu trữ tại Bộ môn dược liệu, Trường Đại Học Tây Đô.

3.2.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học

3.2.2.1. Khảo sát hình thái

Quan sát các đặc điểm hình thái của toàn cây Đinh lăng tươi và mô tả bộ phận dùng bên ngoài của dược liệu như màu sắc, kích thước, hình dáng,…(ĐH Y Dược TPHCM, 2014, Phạm Hoàng Hộ, 2003).

3.2.2.2. Khảo sát vi phẫu

Chọn mẫu có tính đại diện, không quá già cũng không quá non. Để quan sát cấu tạo bên trong của những cơ quan thực vật thì nó được thực hiện bằng phương pháp cắt lát mỏng bằng tay và nhuộm hai màu với các cơ quan cắt ra thành từng khoanh (vi phẫu) trước khi quan sát. Nếu mẫu cắt là lá thì thường lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và một phần cuống lá ở hai bên. Nếu là thân thì thường cắt ở lóng. Nếu là rễ thì cắt ở phần rễ non (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Trương Thị Đẹp, 2014).

Có 2 loại phẫu thức được sử dụng:

Phẫu thức ngang: Lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục mẫu cắt.

Phẫu thức dọc: Lát cắt nằm trong mặt phẳng song song với trục mẫu cắt, thường sử dụng cho thân và rễ để quan sát các ống tiết hay ống nhựa mủ.

Nhuộm mẫu bằng cách nhuộm kép son phèn lục iod:

- Ngâm lát cắt vào dung dịch javel cho đến khi thấy lát cắt trắng, sau đó rửa lại bằng nước cất nhiều lần.

- Tiếp theo ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic trong vài phút để loại bỏ hết javel. Rửa lại bằng nước cất.

- Ngâm lát cắt vào dung dịch son phèn lục iod cho đến khi lát cắt bắt được màu. Rửa lại nhiều lần bằng nước cất cho đến hết màu.

- Vi phẫu sau khi nhuộm xong thì được ngâm trong nước cất.

Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X, 40X và được ghi nhận lại bằng các thiết bị điện tử như máy ảnh, điện thoại di động,… (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Trương Thị Đẹp, 2014).

3.2.2.3. Khảo sát bột Dược liệu

Lấy bộ phận lá, thân, rễ dược liệu Đinh lăng khảo sát (cũng là mẫu dùng cắt vi phẫu) cắt nhỏ, phơi sấy ở nhiệt độ 60 oC (hoặc phơi trong bóng râm) đến khô, xay bột mịn, rây qua rây cỡ 32 (rây mịn). Phần còn lại trên rây được đem đi sấy, xay và rây.

Bột dược liệu được quan sát bằng cách: Lấy một lượng nhỏ bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm cho lên một phiến kính (lame) rồi nhỏ 1 - 2 giọt nước sau đó khuấy kỹ sau đó đậy lamelle lại và cuối cùng là soi kính hiển vi bắt đầu bằng vật kính 10X, sau đó với vật kính 40X.

Trước khi soi kính hiển vi phải quan sát bằng cảm quan để có thêm yếu tố kiểm nghiệm.

Các cấu tử tìm thấy được chụp lại bằng điện thoại trực tiếp qua thị kính (ĐH Y Dược TPHCM, 2014).

3.2.3. Thử tinh khiết

3.2.3.1. Xác định độ ẩm

Phương pháp: Dùng cân phân tích OHAUS PAJ 2102 để tiến hành xác định độ ẩm của dược liệu.

Độ ẩm dược liệu không quá 13,0 %, tiến hành theo phụ lục 9.6 của DĐVN IV (2009).

Cách thực hiện bằng cách trải mỏng khoảng 1,5 g dược liệu đã được nghiền mịn lên dĩa cân và tiến hành xác định độ ẩm theo hướng dẫn sử dụng cân phân tích OHAUS PAJ 2102.

3.2.3.2. Xác định tro toàn phần

- Không quá 8,0 %.

- Cách tiến hành: Cân khoảng 2 g dược liệu tiến hành theo phụ lục 9.8, phương pháp của DĐVN IV (2009).

3.2.3.3. Xác định chất chiết được trong dược liệu

- Không được ít hơn 5,0 %. Theo phụ lục 12.10 DĐVN IV.

- Cân chính xác khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón. Thêm khoảng 50 ml nước cất, đậy kín, cân lại khối lượng, sau đó để yên trong 1 giờ. Đun sôi nhẹ dưới hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình ra  cân lại khối lượng, dùng nước bổ sung lại khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc thô vào bình  lấy khoảng 25 ml vào cốc thủy tinh đã được bì khối lượng cốc. Cô cách thủy đến cắn khô  cắn thu được đem sấy ở 105 oC trong 3 giờ  lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân nhanh để xác định khối lượng và tính phần trăm chất chiết được.

b x 20,000

Trong đó:

X % =

b: Khối lượng cắn (g).

a x (100 − h)

a: Khối lượng dược liệu cân (g). h: Độ ẩm (%).

Tất cả các chỉ tiêu thử tinh khiết nói trên đều được lấy kết quả là giá trị trung bình của 3 lần thử độc lập.

3.2.4. Nghiên cứu về hóa học

3.2.4.1. Định tính

Theo Dược Điển Việt Nam IV (2009).

Bột dược liệu Đinh lăng Phản ứng tạo bọt và màu

Lấy khoảng 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 1 phút, sẽ thấy bọt bền trong 10 phút.

Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 90 % (TT), ngâm trong 3 giờ, lắc, lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:

- Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric (TT), tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ.

- Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml (TT) Fehling, sau đó đun sôi  hiện tủa đỏ gạch.

Lấy một ít bột dược liệu đặt trên khay sứ, nhỏ thêm 1 giọt dung dịch Lugol (TT) 

bột chuyển sang màu xanh đen (Dược điển Việt Nam IV, 2009).

Cao Đinh lăng Phản ứng tạo bọt và màu

Lấy khoảng 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 1 phút, sẽ thấy bọt bền trong 10 phút.

Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 90 % (TT), ngâm trong 3 giờ, lắc, lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:

- Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric (TT), tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ phía trên có màu xanh.

- Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml (TT) fehling, sau đó đun sôi  hiện tủa đỏ gạch (Dược điển Việt Nam IV, 2009).

Phương pháp Sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4):

Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Merck.

Dung môi khai triển: n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5, lớp trên).

Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu và các cao phân đoạn.

Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol

(TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rò vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.

Dung môi khai triển: Chloroform - methanol - nước (65 : 35 : 10; lớp dưới).

Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu và các cao phân đoạn.

Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT) và (TT) acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rò vết. Quan sát dưới ánh sáng thường (Dược điển Việt Nam IV, 2009).

Chấm sắc ký với chất chuẩn Acid oleanolic.

Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat (7 : 3).

Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu, các cao phân đoạn và chất chuẩn acid oleanolic.

Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 100 oC cho tới khi hiện rò vết. Quan sát dưới ánh sáng thường (Dược điển Việt Nam IV, 2009).

3.2.4.2. Định tính sơ bộ các nhóm chính trong thân và rễ Đinh lăng

Nguyên tắc: Chiết tách nguyên liệu thành các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần với các dung môi: Ether ethylic, ethanol và nước. Thực hiện trên 20 g dược liệu, chiết phân đoạn thu được 50 ml dịch chiết ether ethylic, 50 ml dịch chiết ethanol, 50 ml dịch chiết nước. Xác định các nhóm chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng (ĐH Y Dược TPHCM, 2014).

Mẫu thử

Ether ethylic

Dịch chiết ether

Bã Dược liệu

Dịch chiết cồn

Bã Dược liệu

Ethanol / hồi lưu

HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether

Dịch chiết cồn thủy phân

Nước / cách thủy

Dịch chiết nước

Bã Dược liệu

HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether

Dịch chiết nước thủy phân

Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết

Bốc hơi đến cắn. Hòa tan trong cồn. Làm phản ứng cyanidin

Phản ứng Bortrager

Bốc hơi trên chén sứ đến cắn. Cho tác dụng với kiềm, soi trong UV

Dịch chiết ether

Bốc hơi đến cắn, hòa cắn trong nước acid. Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid

Bốc hơi trên chén sứ đến cắn. Làm phản ứng Liebermann- Burchard

Có màu đỏ

Flavonoid

Anthraquinon

Dung dịch kiềm có màu đỏ

Coumarin

Tăng cường độ phát quang khi soi UV

Alkaloid

Có tủa

Triterpenoid

Lớp phân cách có màu đỏ nâu – tím và vòng màu lục hay tím khuếch tán lên

Bốc hơi trên chén sứ đến cắn

Chất béo

Bốc hơi trên chén sứ. Có mùi thơm, thêm vài giọt cồn, bốc hơi hết cồn

Acid sulfuric đặc Màu lục – xanh dương

Carotenoid

đậm

Tinh dầu

Thuốc thử Carr-Price Màu xanh chuyễn sang đỏ

Cắn có mùi thơm

Nhỏ lên giấy mỏng.

Bay hơi ether

Có vết trong mờ

Hình 3.2. Sơ đồ phân tích các chất trong dịch chiết ether.