Thí Nghiệm 1: Khảo Sát Nồng Độ Ba Và Naa Đến Khả Năng Nhân Chồi Của Lan

2.3.2. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm

2.3.2.1 Phòng thí nghiệm

Khu vực rửa

Khu vực riêng dùng để rửa mẫu, rửa chai lọ và dụng cụ nuôi cấy.

Phòng pha

- Là phòng được sử dụng đầu tiên trong nuôi cấy mô, phòng phải đảm bảo vệ sinh, thoáng mát và vô trùng. Phòng này dùng để cân pha hoá chất, nấu hấp môi trường.

- Trang thiết bị cần có trong phòng: bàn, bồn rửa, kệ để hoá chất và dụng cụ, tủ lạnh, tủ sấy, máy đo pH, nồi hấp vô trùng, cân điện tử, máy lắc.

Phòng cấy

- Thường phòng cấy có diện tích nhỏ khoảng 10 – 15 m2, kín gió, có 2 lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Để tăng hiệu suất khi làm việc, phòng cấy phải được trang bị máy lạnh. Phòng cấy đòi hỏi phải vô trùng tuyệt đối do đó phải thường xuyên khử trùng bằng formol, thuốc tím hoặc đèn UV (ultra violet).

- Tiến hành tiệt trùng bằng:

+ Dung dịch formol phun thành sương mù

+ Chiếu tia UV trong 3 – 4 giờ đủ để thao tác 2 – 3 giờ

- Trang thiết bị cần có trong phòng: bàn để tủ cấy, tủ cấy vô trùng, kệ để môi trường đã hấp và vô trùng, đèn, đèn cồn, đèn đốt bằng gas, dao, kéo, kẹp, dĩa petri, bút viết trên dụng cụ thuỷ tinh.

Phòng nuôi cây (phòng sáng)

- Sau khi cấy xong, cây được đưa vào phòng nuôi cây. Phòng nuôi cây phải đảm bảo đầy đủ ánh sáng, đủ lạnh để cây phát triển, khoảng 18 – 250C, thường 1 máy điều hoà có công suất 1,5 KW giữ mát cho 15 m2 – 30 m2 phòng nuôi cây.

- Theo chế độ chiếu sáng ta chia thành:

+ Buồng tối liên tục (nuôi tạo mô sẹo, giữ mô sẹo).

+ Buồng sáng theo chu kỳ 8 – 12 giờ/ngày.

+ Buồng sáng liên tục.

- Trang thiết bị cần có trong phòng: kệ, đèn neon, máy lạnh, dụng cụ đo ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ.

2.3.2.2 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm

Môi trường cơ bản là môi trường MS có bổ sung thêm: Đường mía (sacharose) 30g/l

Agar 8,5 g/l

Than hoạt tính 0,5 g/l

Môi trường được điều chỉnh bằng NaOH và HCl để đạt pH = 5,8 và được khử trùng bằng Autoclave ở áp suất 1atm, nhiệt độ 1210 trong thời gian 20 phút.

2.3.2.3 Các hóa chất

- Nước cất.

- Cồn 700, cồn 960.

- NAA (1-Naphthalene acetic acid).

- BA (6-Benzyladenine).

2.4 Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm đơn yếu tố và hai yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

Điều kiện nuôi cấy

Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Nhiệt độ phòng nuôi cấy là: 18 – 250 C

Ẩm độ trung bình: 70 – 80%

2.4.1 Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya Mục tiêu: xác định nồng độ BA và NAA thích hợp đến khả năng nhân chồi của

lan Cattleya.

Vật liệu: cụm chồi lan Cattleya in vitro đường kính 0,4 – 0,5 cm.

Phương pháp thí nghiệm: thí nghiệm 2 yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

Yếu tố A: 3 mức nồng độ NAA: 0,1 mg/l, 0,2 mg/l, 0,3 mg/l Yếu tố B: 4 mức nồng độ BA: 1 mg/l, 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l

- Số nghiệm thức: 12

- Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3

- Số chai cho mỗi lần lặp lại: 5

- Số mẫu/chai: 4

- Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 = 15

- Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 4 = 60

- Tổng số mẫu: 60 x 12 = 720

- Môi trường nền: môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l

Bố trí thí nghiệm:

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi

Nồng độ BA (mg/l)

	Nồng độ NAA (mg/l)
0,1	0,2	0,3
1	NT1	NT5	NT9
2	NT2	NT6	NT10
3	NT3	NT7	NT11
4	NT4	NT8	NT12

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 133 trang tài liệu này.

Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi định kỳ 10 ngày/lần đến 90 ngày sau cấy

- Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt thạch lên đỉnh cụm chồi

- Số chồi (chồi): đếm số chồi hình thành trung bình của các cụm trong 5 chai

- Trọng lượng tươi cụm chồi 90 ngày sau cấy (g): cân và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai.

- Đường kính cụm chồi 90 ngày sau cấy (cm): đo và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai.

2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya

Mục tiêu: xác định liều lượng và loại dịch chiết thích hợp đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya.

Vật liệu: cụm chồi lan Cattleya in vitro đường kính 0,3 – 0,4 cm.

Phương pháp thí nghiệm: thí nghiệm 2 yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

Yếu tố A: 3 mức nồng độ: 10%, 20%, 30%

Yếu tố B: 3 loại dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa

- Số nghiệm thức: 9

- Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3

- Số chai cho mỗi lần lặp lại: 5

- Số mẫu/chai: 4

- Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 = 15

- Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 4 = 60

- Tổng số mẫu: 60 x 9 = 540

- Môi trường nền: môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l

Bố trí thí nghiệm:

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của các dịch chiết đến khả năng nhân chồi

Dịch chiết

Phần trăm dịch chiết (%)
	10%	20%	30%
Dịch chiết khoai tây	NT1	NT4	NT7
Dịch chiết cà rốt	NT2	NT5	NT8
Nước dừa	NT3	NT6	NT9

Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi định kỳ 10 ngày/lần đến 90 ngày sau cấy

- Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt thạch lên đỉnh cụm chồi

- Số chồi (chồi): đếm số chồi hình thành trung bình của các cụm trong 5 chai

- Trọng lượng tươi cụm chồi 90 ngày sau cấy (g): cân và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai.

- Đường kính cụm chồi 90 ngày sau cấy (cm): đo và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai.

2.4.3 Thí nghiệm 3: khảo sát nồng độ NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya

Mục đích: xác định nồng độ NAA thích hợp đến khả năng tạo rễ của lan Cattleya.

Vật liệu: cây con lan Cattleya in vitro cao 1,5 – 2 cm.

Phương pháp thí nghiệm: thí nghiệm đơn yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

- Số nghiệm thức: 6

- Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3

- Số chai cho mỗi lần lặp lại: 5

- Số mẫu/chai: 4

- Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 = 15

- Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 4 = 60

- Tổng số mẫu: 60 x 6 = 360

- Môi trường nền: môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l

Bố trí thí nghiệm: NT1: 0 mg/l NAA NT2: 1 mg/l NAA

NT3: 2 mg/l NAA

NT4: 3 mg/l NAA NT5: 4 mg/l NAA NT6: 5 mg/l NAA

Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi định kỳ 10 ngày/lần đến 80 ngày sau cấy

- Số rễ (rễ): đếm số rễ hình thành trung bình các cây trong 5 chai

- Tốc độ ra rễ (rễ/cây/số ngày): rễ/cây/10

- Chiều dài rễ (cm): đo từ cổ rễ đến đỉnh rễ ở 80 ngày sau cấy.

2.5 Xử lý số liệu

Số liệu được lưu trữ và xử lý thô bằng phần mềm Excel.

Phân tích ANOVA bằng phần mềm SAS 9.1 (Statistical Analysis System - USA, 1999). Trắc nghiệm phân hạng các trung bình nghiệm thức ở mức α = 0,01 hoặc α = 0,05.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya

Nhằm kích thích quá trình sinh trưởng số chồi và chiều cao chồi, việc bổ sung BA và NAA vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết. Để tìm nồng độ thích hợp cho lan Cattleya, thí nghiệm được thực hiện với nồng độ BA được thay đổi từ 1, 2, 3, 4 mg/l và nồng độ NAA từ 0,1; 0,2; 0,3 mg/l.

Theo Nguyễn Văn Uyển và ctv (1993), cho rằng cytokinin cùng auxin điều tiết chu trình tế bào, kích thích sự phân chia tế bào một cách mạnh mẽ. Vì vậy khi bổ sung vào môi trường các chất NAA và BA sẽ giúp chồi sinh trưởng về chiều cao.

Kết quả về chiều cao chồi được thể hiện ở bảng 3.1a cho thấy:

Nhìn chung, ở giai đoạn 10 – 40 NSC, chiều cao chồi có tăng nhưng không đáng kể. Sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa về mặt thống kê. Đến giai đoạn 40 NSC, chiều cao chồi dao động từ 0,74 – 0,92 cm.