Ảnh hưởng của BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya Cattleya sp. in vitro

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi 26

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của các dịch chiết đến khả năng nhân chồi 27

Bảng 3.1a Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi giai đoạn 10 – 40 NSC (cm) 31

Bảng 3.1b Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi giai đoạn 50 – 90 NSC (cm) 32

Bảng 3.2a Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi giai đoạn 30 – 60 NSC (chồi) 33

Bảng 3.2b Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi giai đoạn 70 – 90 NSC (chồi) 35

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến đường kính (cm) và khối lượng (g) cụm chồi giai đoạn 90 NSC 37

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 133 trang tài liệu này.

Bảng 3.4a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến chiều cao chồi giai đoạn 10 – 40 NSC (cm) 38

Bảng 3.4b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến chiều cao chồi giai đoạn 50 – 90 NSC (cm) 40

Bảng 3.5a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến số chồi giai đoạn 10 – 60 NSC (chồi) 42

Bảng 3.5b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến số chồi giai đoạn 70 – 90 NSC (chồi) 44

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến đường kính (cm) và khối lượng (g) cụm chồi giai đoạn 90 NSC 45

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự tạo rễ của Cattleya giai đoạn 20 – 80 NSC (rễ/cây) 46

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ ra rễ của Cattleya giai đoạn 10 – 80 NSC (rễ/cây/10 ngày) 48

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến chiều dài rễ của Cattleya giai đoạn 80 NSC (cm) 49

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1 Một số hình ảnh lan Cattleya 14

Hình 1.2 Loại lan Cattleya dùng trong TN 15

Hình 1.3 Quy trình kỹ thuật cơ bản nhân giống hoa lan bằng phương pháp NCM tế bào 18

Hình 1.4 Mẫu cụm chồi lan Cattleya được sử dụng trong thí nghiệm 55

Hình 1.5 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 giai đoạn 90 NSC 55

Hình 1.6 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 2 giai đoạn 90 NSC 56

Hình 1.7 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 3 giai đoạn 80 NSC 56

Hình 1.8 Cân trọng lượng cụm chồi tươi 57

Hình 1.9 Đo đường kính cụm chồi 57

GIỚI THIỆU‌

Đặt vấn đề

Ngày nay, khi đời sống được nâng cao thì hoa là một nhu cầu không thể thiếu của con người. Với hương thơm, màu sắc và ý nghĩa riêng của mình, mỗi loài hoa góp phần làm đẹp thiên nhiên, làm đẹp cho cuộc sống và là biểu tượng cho cái đẹp, hạnh phúc và sức sống cho con người. Trong muôn ngàn loài hoa, hiếm có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ bằng hoa lan. Hoa lan không chỉ mang vẻ đẹp đài các, sang trọng mà còn ấm áp, gần gũi và chất chứa trong mình những giá trị tiềm ẩn, mới lạ, hấp dẫn. Đặc biệt, lan Cattleya rất được ưa thích về màu sắc, kiểu dáng trang nhã nhưng cũng không kém phần kiêu sa. Chính vì vậy, việc trồng lan Cattleya không chỉ dừng lại ở quy mô gia đình mà đã nhanh chóng được mở rộng và trở thành lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhiều nước trên thế giới như Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ. Trong đó, Việt Nam cũng là một nước có nhiều tiềm năng trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực, có khí hậu thích hợp và nhiều nguyên liệu làm giá thể tốt cho cây lan sinh trưởng.

Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu hoa trong nước cũng như xuất khẩu đòi hỏi phải có một số lượng lớn cây giống đồng đều trong khi Cattleya lại là một loài lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện nhân vô tính tự nhiên. Do đó việc nghiên cứu để tìm ra phương pháp nhân giống tối ưu cho lan Cattleya là hết sức cần thiết.

Trong các phương pháp nhân giống lan Cattleya hiện nay thì nuôi cấy mô là phương pháp thích hợp để nhân nhanh giống lan trong một thời gian ngắn, tạo ra các dòng cây con đồng nhất, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền nhưng không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết. Phương pháp này có thể tạo ra số lượng hoa lan lớn mà vẫn đáp ứng được yêu cầu ngày càng khắt khe hơn của người chơi hoa lan về màu sắc, kiểu dáng phải mới

lạ, độc đáo, cây sinh trưởng phát triển tốt, khả năng thích ứng với môi trường cao, ít nhiễm sâu bệnh, hoa tươi lâu, có độ bền, đẹp về màu sắc.

Hiện nay, có rất nhiều chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô. Đặc biệt, các chất BA, NAA và dịch chiết là các chất phổ biến trên thị trường bởi vì tính không độc, an toàn với môi trường, dễ tìm, giá cả hợp lý và tác động nhanh đến quá trình nhân chồi, tạo rễ.

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro” được tiến hành.

Mục tiêu – Yêu cầu Mục tiêu‌

- Xác định liều lượng của BA và NAA thích hợp để nhân chồi lan Cattleya.

- Xác định liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa thích hợp cho sự sinh trưởng chồi lan Cattleya.

- Xác định liều lượng NAA thích hợp cho sự tạo rễ lan Cattleya.

Yêu cầu

- Tìm hiểu và đánh giá sự tác động của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và một số dịch chiết đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya.

- Theo dõi sự sinh trưởng của lan Cattleya thông qua chỉ tiêu số chồi, chiều cao của chồi và chiều dài rễ, số rễ.

- Đánh giá ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ lan Cattleya.

Giới hạn

Đề tài được tiến hành trong 4 tháng nên chỉ giới hạn vào việc thực hiện các thí nghiệm ở giai đoạn nhân chồi và tạo rễ của lan Cattleya tại phòng nuôi cấy mô bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông học.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật gắn liền với các sự kiện nổi bật như sau:

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết về tính toàn năng của tế bào vào thực nghiệm. Theo ông, tất cả tế bào thực vật đều có tính toàn năng, mỗi tế bào đều mang một lượng thông tin di truyền đầy đủ của cơ thể và khi gặp điều kiện thuận lợi thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tuy nhiên, ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công.

Năm 1922, Kotte và Robbins thực hiện lại thí nghiệm của Haberlandt và đã thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ đầu rễ một cây hòa thảo.

Năm 1934, White (Hoa Kỳ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cây cà chua trên môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường và dịch chiết nấm men. Ở các thí nghiệm tiếp theo, White chứng minh có thể thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic acid. Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau.

Sau đó ít lâu, Went và Thimann phát hiện ra chất điều hòa sinh trưởng đầu tiên là IAA (Indol acetic acid).

Năm 1939, cùng với Nobercourt, Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự

sinh trưởng trong thời gian dài của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường rắn bằng thạch.

Năm 1941, Overbeck (Hoa Kỳ), chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi họ cà (Datura).

Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công, như Napthyl acetic acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4D đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy.

Năm 1955, Skoog và tìm ra chất điều hòa sinh trưởng trong tinh dịch cá bẹ là 6- Furfurylaminopurine và đặt tên là Kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bào.

Việc phát hiện vai trò của NAA, IAA, 2,4D và Kinetin cùng với phát hiện vai trò của các vitamin và nước dừa là một bước tiến quan trọng, đây là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hoá học, cho việc làm các thí nghiệm ổn định và dẫn đến những thành công tiếp theo của ngành khoa học này.

Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ. Ngược lại thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tượng này được xác nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào sự điều khiển sinh trưởng, phát triển của mô tế bào trong nuôi cấy.

Từ 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng cách sử dụng máy lắc.

Năm 1960, Bergman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được hầu hết là tế bào đơn mà không phải là dính cụm. Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường, tiếp tục phân chia và tái tạo lại mô sẹo. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào, chứng minh được tính toàn thế của tế bào.

Năm 1960, Cooking (Anh) công bố có thể dùng men cellulose để phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không vỏ bọc, gọi là protoplast.

Đầu những năm 1970, Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia, tạo nên một quần thể tế bào trong môi trường lỏng.

Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí từ các cơ quan tử từ bên ngoài. Các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có kết quả hơn.

Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xướng về vấn đề biến tính của tế bào. Ông cho rằng các tế bào có khả năng hấp thụ DNA ngoại lai vào, gây nên sự biến tính ở thực vật.

Từ 1980 đến 1992, có nhiều các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực vật được công bố, hàng loạt các công trình chuyển gene ngoại lai vào nhiều họ thực vật.

Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong những ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật. Morel (1960), đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp thì thu được các protocorm mới. Khi để trong các điều kiện thích hợp nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con. Do đó, có thể phục tráng, tạo ra các dòng vô tính không bị nhiễm virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với các cây như: khoai tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác.

Hiện nay, đang bước vào giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng và phát triển mạnh mẽ trong việc nhân giống, chọn tạo giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993).

1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam

Theo Trần Văn Minh (2005), sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật.

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện Khoa Học Việt Nam do Lê Thị Muội khởi xướng. Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast. Và đã thành công khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv, 1978; Lê Thị Xuân và ctv, 1978). Tiếp đó là thành công nuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981). Phòng thí nghiệm tiếp theo được đặt tại phân viện Khoa Học Việt Nam ở TP. Hồ Chí Minh, sau đó là Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây. Đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Rau Quả Trung ương, các trường Đại học), mà có cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh).

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh. Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm Nghiệp). Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và ctv, 1994; Định Thị Tòng và ctv, 1994). Các kết quả về dung hợp tế bào trần, chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và ctv, 1993, 1997). Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Di Truyền Giống Nông Nghiệp. Nuôi cấy các cây dược liệu quí để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và ctv, 1995; Bùi Bá Bổng, 1995).

Không dừng lại ở đó, các công trình nghiên cứu ngày càng đạt được những bước tiến vượt bậc. Cụ thể: