Lợi Ích Của Phương Pháp Nhân Giống Bằng Nuôi Cấy Mô

- Tại Viện sinh học Nhiệt đới, từ đầu những năm 2000, đã tập trung vào công nghệ nuôi cấy mô các cây công nghiệp như cà phê, hồ tiêu và nhóm cây lâm nghiệp thân gỗ như Paulownia, dó bầu, Neem... Hoàn chỉnh công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống, tạo các giống cây trồng nông lâm nghiệp sạch bệnh. Nghiên cứu cải thiện điều kiện nuôi cấy invitro, biorector cho các cây có giá trị như cây thuốc, cây lấy dầu, hoa lan, cây cảnh... Lần đầu tiên trong nước, các nhà nghiên cứu đã nuôi cấy thành công mô phôi vô tính (soma), mô chồi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng tạo điều kiện rất thuận lợi cho việc nhân sinh khối quy mô lớn tạo sản phẩm có khả năng thương mại hóa. Tạo và nuôi nhân rễ bất định sâm Ngọc Linh và bước đầu ghi nhận được sự hình thành rễ tơ (hairy root) sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, tạo điều kiện cho việc nuôi nhân quy mô lớn sinh khối nhằm thu hoạt chất phục vụ ngành mỹ phẩm và y dược. Tạo thành công mô sẹo/rễ bất định hai cây dược liệu quý là Xạ đen và Tam thất nhằm nhân nhanh sinh khối phục vụ sản xuất hợp chất thứ cấp. Đã nhân giống thành công giống lan đặc hữu Việt Nam (Dendrobium farinatum Schildh. et Schraut) (Bích Diệp, 2014).

- Các công trình nghiên cứu tại Lâm Đồng đạt được nhiều thành tựu: Dương Tấn Nhựt thu được nhiều kết quả trong nuôi cấy các loài hoa cúc, lyli, salem, hồng môn, hoa hồng,… và đặc biệt ứng dụng hệ chiếu sáng đơn sắc của công nghệ đèn LED vào luận án tại Đại học Kagawa, Nhật Bản (2002). Mới đây tác giả đã đạt được nhiều kết quả mới về công nghệ sinh khối sâm K5 Panax vietnamensis, thông đỏ Taxus wallichiana, công nghệ phôi vô tính các loài Hồ điệp (Phalaenopsis spp.),… mở ra hướng công nghệ tạo giống chủ động và sinh khối chất lượng cao với những công trình phong phú cùng những đề tài tiềm năng lớn; Nguyễn Văn Kết và ctv triển khai khá thành công nuôi cấy các loài lan rừng Cát Tiên - Lâm Đồng - Đồng Nai, và đặc biệt là đưa từng bước công nghệ nuôi cấy mô hiện đại với các hệ thống Bioreactor vào thực tiễn nhân giống, xuất phát từ luận án tiến sĩ tại Đại học Chungbuk, Hàn Quốc (2005); Phạm Xuân Tùng đã phát triển công nghệ tạo giống khoai tây kết hợp nuôi cấy in vitro (củ bi và siêu bi - microtuber) với công nghệ gieo hạt. Hiện nay tác giả cùng các cộng sự tiếp tục triển khai kết quả công nghệ lai tạo và chọn lọc các dòng hoa quý: cúc, đồng tiền, cẩm chướng… có giá trị thương mại cao (Lê Xuân Thám, n.d.).

1.1.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô

Tạo ra các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ.

Nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn. Tạo ra các cây con sạch bệnh.

Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất.

Việc trao đổi giống quốc tế các nguồn gen sạch bệnh nuôi trong ống nghiệm được thực hiện dễ dàng.

Thông qua nuôi cấy mô có thể ứng dụng việc chuyển gen cho những thực vật bậc cao để chọn tạo giống mới theo yêu cầu sản xuất (Bùi Bá Bổng, 1995).

1.1.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Dương Công Kiên (2002), nuôi cấy mô thực vật có một số phương pháp như sau:

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên.

Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Sau một thời gian, từ đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển, vươn thân, ra lá, rễ, để trở thành một cây hoàn chỉnh.

Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có bổ sung auxin. Trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo, khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ, từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn.

Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp, sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ, gọi là tế bào đơn. Sau đó, tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường thích hợp để phát triển, tăng sinh khối.

Nuôi cấy protoplast

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng.

Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo.

Mô sẹo này được phát triển thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.

1.1.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong đời sống thực vật, ngoài các chất dinh dưỡng như glucid, protein, lipid, cây còn nhiều chất hoạt tính sinh lý như các vitamine, enzyme, các chất điều hòa sinh trưởng (phytohormon). Trong công nghệ nuôi cấy mô thực vật, các phytphormon rất quan trọng trong quá trình thay đổi các đặc trưng hình thái sinh lý của cây trồng, đặc biệt là trong tạo mô sẹo và hình thành cây hoàn chỉnh (Lê Văn Tri, 1997). Một số đặc tính và cơ chế tác dụng của nhóm chất như auxin, cytokinin.

1.1.5.1 Auxin

Auxin là một chất có nhân Idol, có công thức hóa học là C10H9O2N. Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol acetic acid (IAA). IAA có dẫn xuất là 1- naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D). NAA được Went và Thimann phát hiện năm 1937 và là một auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. Trong cây IAA tập trung nhiều trong các mô non (chồi, lá đang phát triển), trong hạt, trong hạt nảy mầm (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976).

Tác động sinh lý của auxin

Auxin có vai trò điều hòa quan trọng trong việc kìm hãm sự phát triển của chồi bên (duy trì hiện tượng ưu thế ngọn).

Auxin gây tính hướng động của cây (hướng quang và hướng địa).

Auxin kích thích quá trình tăng trưởng nhờ tác dụng kéo giãn tế bào. Sự kéo tế bào diễn ra đồng thời trên hai trục (trục ngang và trục dọc). Nhờ vào tác dụng này mà auxin giúp tăng diện tích lá, tăng đường kính và chiều dài cành, thân, rễ; làm củ, quả phình to ra.

Auxin kích thích sự tăng trưởng của quả, ngăn ngừa hiện tượng rụng lá, quả, kích thích sự ra rễ (Nguyễn Văn Uyển, 1989).

Ứng dụng

Auxin kích thích sự ra rễ đặc biệt là rễ bất định trên cành giâm, cành chiết và trên mô nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô, auxin (IBA, NAA) cũng có tác dụng tạo rễ tốt.

Để tăng đậu quả, tăng sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt, người ta xử lý auxin dưới dạng NAA 20 ppm, 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D) 10 ppm cho một số cây trồng như cà chua, cam, chanh.

Để kéo dài sự chín của quả và dùng bảo quản quả lâu, sử dụng dung dịch NAA (10

– 20 ppm) (Nguyễn Văn Uyển, 1989).

1.1.5.2 Cytokinin

Năm 1955, Skoog và Miller tách ra từ 500g DNA (deoxyribo nucleic acid) của tinh dịch cá trích một chất kết tinh và có hoạt tính đối với mô tủy cây thuốc lá và đặt tên là kinetin. Cytokinin là chất điều hòa tăng trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Cytokinin thường gặp là kinetin và 6-benzyl aminopurin (BA). Cytokinin được vận chuyển từ mô phân sinh đỉnh rễ (là nơi tổng hợp nhiều cytokinin trong cây). Do đó, cytokinin có hàm lượng cao nhất ở phôi, quả non, rễ (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976).

Vai trò sinh học và ứng dụng

Trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt của auxin là rất cần thiết để kích thích sự phân bào, nhưng giai đoạn sau phôi phải được nuôi cấy trên môi trường có cytokinin để biệt hóa chồi (Vũ Văn Vụ, 1999). Cytokinin cùng auxin điều tiết chu trình tế bào, kích thích sự phân chia tế bào một cách mạnh mẽ. Nếu auxin/cytokinin >1: kích thích ra rễ; auxin/cytokinin <1: kích thích hình thành chồi; auxin/cytokinin =1: kích thích hình thành mô sẹo (Nguyễn Văn Uyển và ctv, 1993).

Cytokinin kích thích sự phát triển mầm hoa.

Cytokinin cảm ứng hình thành chồi cây từ mô sẹo nuôi cấy, duy trì sự trẻ hóa của các cơ quan và loại bỏ ưu thế ngọn cũng như hạn chế sự phát triển của rễ.

Cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô thực vật: TDZ (Thiazuron), BA (6- Benzylaminopurine), kinetin (6- Furfuryl amino purine) và cytokinin tự nhiên trong nước dừa được ứng dụng rộng rãi trong môi trường tạo chồi in vitro. (Nguyễn Văn Uyển, 1989).

1.1.6 Dịch chiết sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Dịch chiết hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả qua việc cung cấp các thành phần dinh dưỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần có tác dụng như chất kích thích sinh trưởng (Trần Văn Minh, 2005).

Các nghiên cứu của Pierik và ctv (1988), Li và ctv (2001), Chyuam và ctv (2010), Songjun và ctv (2012, 2013) đều cho thấy, khi bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh cây, hệ số nhân chồi của một số loài lan hài cao hơn hẳn môi trường không bổ sung các chất này. Các hợp chất hữu cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy in vitro như nước dừa, dịch chiết chuối, cà rốt, khoai tây, peptone và triptone, đây là những nhân tố đóng vai trò không kém phần quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Cúc và ctv, 2013).

1.1.6.1 Khoai tây

Củ khoai tây chứa carbohydrate, protein, chất béo, một vài vitamin, phenolic và một ít amino acid, acid béo (Phạm Hữu Nguyên, 2007). Theo Trần Văn Minh (2005), dịch chiết khoai tây có tác dụng làm tăng sự sinh trưởng của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy.

1.1.6.2 Cà rốt

Cà rốt chứa nhiều loại vitamin, chứa Beta-carotenoid và carotenoid (Lê Vân, 2015).

Bổ sung vào môi trường MS giúp chồi sinh trưởng.

1.1.6.3 Nước dừa

Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng cytokinin được tìm thấy trong nước dừa. Bên cạnh đó trong nước dừa có chứa acid lauric, dồi dào vitamin, khoáng chất và chất dinh dưỡng, ít đường và Natri nhưng lại có nhiều kali, canxi và chloride (Hoa Phạm, 2015).

Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật khó nuôi cấy (Trần Văn Minh, 2005).

1.1.7 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm

Môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường nền MS (Murashige và Skoog, 1962).

Môi trường nền MS là một trong những loại môi trường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, đặc biệt ở những môi trường tái sinh.

Môi trường nền MS là môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy. Môi trường nền MS là môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng (Trần Văn Minh, 2005).