Hình Ảnh Minh Hoạ Giải Trình Tự Một Đoạn Dna (Nguồn: Sanger Cequencing Read Display.gif)

Hình 1.9. Hình ảnh minh hoạ giải trình tự một đoạn DNA (Nguồn: Sanger cequencing read display.gif)

1.6. Nhiễm khuẩn hô hấp và tình hình kháng kháng sinh do Klebsiella

1.6.1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở nước ngoài Nhiễm khuẩn hô hấp do Klebsiella spp. ở trong cộng đồng là hiếm gặp,‌

thường gặp ở những người có miễn dịch kém như trẻ nhỏ, người già, người mắc bệnh mãn tính ....[29].

Nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. gặp chủ yếu ở trẻ sơ sinh và sơ sinh non yếu. Tỷ lệ chủng kháng và đa kháng kháng sinh cao, nhất là chủng sinh men β- lactamase phổ rộng và KPC. Đặc biệt là những chủng Klebsiella spp. mang gen NDM-1 gây đề kháng các loại kháng sinh hiện có và làm cho Klebsiella spp. trở thành siêu vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh [112], [113], [114].

Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. khác nhau ở các nước. Tại Châu Âu, tỷ lệ Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn ở các bệnh viện từ 3% -17%; ở Thổ Nhĩ Kỳ 26,2% [85], [ 98], [119]. Các chủng Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn bệnh viện đề kháng cao với các kháng sinh ngoại trừ imipenem (IPM) và ciprofloxacin (CIP) [83], tỉ lệ kháng với các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin và quinolon ở cộng đồng là 4% và 21%, tỉ lệ này cao gấp hai lần đối với những chủng phân lập được từ nhiễm trùng bệnh viện. Các chủng phân lập được từ nhiễm trùng bệnh viện đã kháng 60%-100% đối với ampicillin (AM) và cephazolin, xuất hiện chủng kháng với nhiều loại kháng sinh, với IPM và CIP kháng 0%-12% [119]. Các chủng sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBLs) là yếu tố lan tràn và bùng phát nhiễm khuẩn

bệnh viện đồng thời tăng tỉ lệ chủng kháng đa kháng kháng sinh. Tỉ lệ chủng có men ESBLs phân lập ở bệnh nhân viêm phổi nhiễm trùng bệnh viện là 88,9% còn phân lập từ những bệnh nhân viêm phổi không phải do nhiễm trùng bệnh viện là 11,1% [30].

Có thể bạn quan tâm!

• Các Yếu Tố Làm Cho Vi Khuẩn Không Chịu Tác Dụng Của Thuốc Kháng Sinh
• Đề Kháng Thu Được Không Do Sinh Ra Enzym -Lactamase
• Phát Hiện Các Đột Biến 158Delag, 5382Insc Và 6174Delt Bằng Real-Time Pcr (Scort Và Cs, 2006).
• Nuôi Cấy, Phân Lập, Xác Định Căn Nguyên Vi Khuẩn:
• Đặt Khoanh Giấy Kháng Sinh Xác Định Men  - Lactamase Phổ Rộng.
• Tỷ Lệ Và Sự Phân Bố Tỷ Lệ Chủng Klebsiella Phân Lập Từ Bệnh Nhi Nkhhct 0 Đến 6 Tuổi Với Một Số Yếu Tố Liên Quan

Xem toàn bộ 134 trang tài liệu này.

Những báo cáo mới nhất về cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolon của các nhà nghiên cứu cho thấy vai trò chủ yếu là do đột biến trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Năm 1998, Martinez - Martinez và cộng sự [75], lần đầu tiên mô tả chủng Klebsiella pneumoniae kháng nhóm kháng sinh quinolon theo cơ chế lan truyền gen

P.M.G 252 trên plasmid. Sự kháng kháng sinh nhóm quinolon được xác định bởi gen qnr nằm trên các Integron khác nhau. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn bởi nó nói lên rằng gen kháng quinolon có thể lan truyền ngang giữa các vi khuẩn với nhau. Thêm vào đó các integron này đồng thời mang gen kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ ba (do enzym -lactmase phổ rộng hoặc do enzyme cephalosporinase).

Các kháng sinh nhóm quinolon tác động chính lên protein của tế bào vi khuẩn là onr (thuộc nhóm nhân 5 cạnh, protein McbG và MfpA các protein này tham gia tạo dây xoắn AND của vi khuẩn và được gọi là DNA gyrase). Gen mã hóa cho enzym này chính là qnr. Sự đột biến ở gen này sẽ làm cho vi khuẩn kháng lại được các kháng sinh nhóm quinolon [52], [61].

Các gen kháng quinolon nằm trên plasdmid- qnrA được phát hiện lần đầu tiên năm 1998 ở Mỹ, sau đó qnrB, qnrS lần lượt được phát hiện và thấy chúng được phân bố rộng khắp trên toàn cầu. Trên hình ảnh phân bố gen qnr trên thế giới (hình 1.12) Việt Nam nằm trong khu vực có lưu hành gen qnr chủ yếu là qnrA và qnrS.

Tỷ lệ mang gen kháng qnr khác nhau giữa các nước và các khu vực: từ 4% đến 55% tập trung cao ở các nước Đông Nam Á, đặc biệt là Hàn Quốc và Trung Quốc từ 20,3 đến 55%.

Hình 1.10. Sự phân bố gen qnr[Jacob-2009]

Sự kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 (C3G) liên quan đến sự kháng quinolon theo cơ chế plasmid luôn được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Chủng gây bệnh đề kháng với C3G hầu hết tìm thấy ở các bệnh viện [109],[35], [96], [6], [38]. Cũng giống như quinolon, chủng kháng C3G thay đổi tùy theo vùng địa lý. Những thay đổi quan trọng được báo cáo ở châu Á - Thái Bình Dương [109], [6]. Ở Châu Phi số liệu không nhiều, tỷ lệ kháng khoảng 40% [35], [61]. Đa số chủng mang gen qnr đều kèm theo mang enzym ESBL (SHV-5, SHV-7, CTX-M, Veb-1, Oxa-30) hoặc một -lactamase plasmid type AmpC (Fox-5) [46], [51], [39], [60],[61], [102],[107]. Đặc biệt các chủng mang gen kháng CTX-M một gen mã hóa enzym phân hủy Cefotaxime kháng sinh đang được sử dụng nhiều trong điều trị và có những loại CTX-M phân hủy ceptazidime nhanh và mạnh hơn Cefotaxime đã xuất hiện khắp các nước.

Hình 1.11. Hình ảnh phân bố gen CTX-M[109]

1.6.2. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở trong nước:

Nhiễm trùng đường hô hấp là một bệnh chiếm tỷ lệ cao trong các nhóm bệnh ở trẻ em 53,3% (nghiên cứu cơ cấu bệnh tật trong 3 năm 2005-2008 của bệnh viện Thanh Nhàn). Nhiễm khuẩn hô hấp cấp ở trẻ em ở các bệnh viện có tỷ lệ cao : Sain-Paul 36,8%, khoa Nhi - Bệnh viện Bạch Mai 41,35%, Bệnh viện Đaklak 35,5% [22].

Klebsiella là vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn đường hô hấp ở trẻ em nằm viện, nhất là trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ.

Tỷ lệ nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn tiết niệu trẻ em ở bệnh viện 27,62% - 42,12% [1], [ 4]. Các chủng Klebsiella spp. thu được ở bệnh viện nhi kháng lại kháng sinh ngày một tăng cao [5],[11]. Các kháng sinh thông thường như Ampicilline và Cephalothine kháng 97,8% và 91,7%, nhóm quinolon (31,9%) và C3G khá cao ở nhiễm khuẩn bệnh viện ở trẻ em (42,4 - 57,2%) [1]. Những nhiễm khuẩn chung ở người lớn tỷ lệ kháng C3G từ 36,8 - 37,2% và quinolon 31,8% [16].

Tỷ lệ chủng sinh β-lactamases ở Klebsiella khác nhau tuỳ từng bệnh viện. Bệnh viện Chợ Rẫy 61%; Bệnh viện Việt Đức là 39,3%; Bệnh viện Nhi Trung ương 22,68% [19]. Tỷ lệ kháng C3G cao (36,8% - 57,2%) và quinolon (31,8% - 31,9%) [1], [4], [19]. Cho đến nay, ở Việt Nam có nghiên cứu của Cao Thị Bảo Vân và cộng sự với công bố kết quả nghiên cứu sự phân bố gen kháng β- lactam của các chủng thuộc họ Enterobacterriacea phân lập ở Việt nam cho thấy tỷ lệ CTX- M(25,5%); SHV (38,1%) ; TEM (76,3%) [21].

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu:

Tất cả các chủng Klebsiella phân lập được từ bệnh phẩm đường hô hấp của các bệnh nhi từ 0 đến 6 tuổi nằm điều trị tại khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này được thu thập từ hai nhóm :

+ Nhóm từ những bệnh nhi được chẩn đoán là nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính ngay khi nhập viện (như viêm phế quản phổi, viêm phổi, viêm tiểu phế quản phổi....) - gọi là nhóm NKHHCT

+ Nhóm thu thập từ những bệnh nhi được chẩn đoán những bệnh khác ngoài nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính khi nhập viện, mà NKHHCT là bệnh đi kèm hoặc xuất hiện sau thời gian nằm điều trị - gọi là nhóm NKHHCT kết hợp

+ Nhóm bệnh nhi nặng xin về và nhóm tử vong gọi chung là nhóm tử vong.

- Tiêu chuẩn lựa chọn các chủng Klebsiella vào nghiên cứu gen kháng C3G và Quinolon: Tất cả các chủng Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng được xác định theo tiêu chuẩn của CLSI đảm bảo không cùng trên một phòng bệnh trong cùng một ngày nuôi cấy.

2.2. Thiết kế nghiên cứu:

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang.

2.2.1. Cỡ mẫu: Lượng chủng K. pneumoniae có sinh men β-lactamase phổ rộng theo công thức sau:

p(1-p)

n = Z²(1-α/2) x

d²

Trong đó: Z(1-α/2) = 1,96, với độ tin cậy 95%.

p = 2,4. p là tỷ lệ mang gen qnr ở các chủng Klebsiella có sinh men β- lactamase phổ rộng trong nghiên cứu tại Trung Quốc năm 2008 [28].

d = 0,1: là sai số lựa chọn.

n : số mẫu phân lập được Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng. Theo công thức tính cỡ mẫu n= 93. Trên thực tế, nghiên cứu đã phân tích trên 107 mẫu Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng.

2.2.2. Chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện cho đến khi phân lập đủ cỡ mẫu Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng cần nghiên cứu

2.3. Các biến số và chỉ số nghiên cứu:

- Tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của đối tượng nghiên cứu theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp

- Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp.

- Tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon (CTX- M, SHV,TEM, qnr) của các chủng Klebsiella phân lập được theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp.

2.4. Vật liệu và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4.1. Địa điểm thực hiện: Các kỹ thuật xét nghiệm được thực hiện tại:

- Khoa Vi sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương

- Phòng nghiên cứu kháng kháng sinh - Khoa vi sinh thuộc labo lâm sàng bệnh viện Serveral của Đại học tổng hợp Yonsei - Hàn quốc.

2.4.2. Vật liệu nghiên cứu:

 Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ dùng để thu thập bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập, định danh và xác định tính nhạy cảm kháng sinh, nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn

 Môi trường vận chuyển bệnh phẩm: Dung dịch NaCl 0,9% vô trùng đóng sẵn 4,5ml.

 Tăm bông mềm.

 Máy hút dịch hoặc bơm tiêm 10ml.

- Ống nghiệm có nút bông vô khuẩn.

 Nồi cách thủy, tủ sấy khô, nồi hấp ướt.

 Môi trường chocolate, thạch máu, bộ nhuộm gram, thuốc thử oxydase; card định danh cho máy.

 Cân chính xác đến gram, tủ lạnh 4-80C, tủ đông lạnh - 800C.

 Tủ ấm 370C, tủ ấm CO2.

 Card định danh các loại và card định danh trực khuẩn Gram âm GN test kit code 21341 (Hãng Bio-Merieux).

 Que cấy định lượng 10µl, đèn cồn; ống nghiệm chuyên dùng cho máy định danh, lam kính;

Các loại khoanh giấy kháng sinh của hãng Biorad: Ampicilline (AM), Cephalothine(CF), Cefuroxime(CXM), Amoxicilline/Acidclavulanic(AMC), Cefotaxime (CTX), Ceftazidime (CAZ), cefoxitine (FOX), Cefepime(FEP), Co- trimoxazone(SXT), Gentamicin(GM), Amikacin(AK), Tobramycin(TM), Ciprofloxacin(CIP) và Immipenem (IPM).

 Các loại bột kháng sinh: Cefoxitin, Cefoperazon Astreonam Ceftazidime, Ceftazidime/Acid clavulanic, Cefotaxime, Cefotaxime/Acid clavulanic, Piperacilline, Piperacillie/Acid clavulanic, Imipenem, Cefepime( của hãng Bioneer)

 Máy voltex, máy đo độ đục chuẩn của vi khuẩn.

 Máy định danh Vitek 2

Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ dùng để xác định vi khuẩn sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL)

* Dụng cụ:

- Hộp lồng tròn đường kính 90mm.

- Dụng cụ đặt khoanh giấy kháng sinh pince kẹp không có mấu.

- Thước đo vòng ức chế

* Hóa chất và sinh phẩm

+ Môi trường: Thạch Mueller - Hinton (MH).

+ Các chủng vi khuẩn chuẩn quốc tế

- Staphylococcus aureus ATCC 29213

- Escherichia coli ATCC 25922