Nuôi Cấy, Phân Lập, Xác Định Căn Nguyên Vi Khuẩn:

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

- Các chủng Klebsiella pneumoniae chắc chắn có gen CTX,SHV,TEM và qnR càn tìm của phòng xét nghiệm nghiên cứu kháng thuốc thuộc bệnh viện Serveral - Hàn Quốc

Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ dùng trong kỹ thuật PCR

*Sinh phẩm

- Cặp mồi chẩn đoán gen: TEM, SHV,CTX-M-3, CTX-M-9, qnrA, qnrB, qnrS (Hãng Bioneer - Hàn Quốc):

Bảng 2.1. Thông tin các mồi dùng cho nghiên cứu

Gen nằm trên plasmid

Mồi	Trình tự nucleotide (5'->3')	Kích thước phân tử PCR (bp)
Nhóm gen mã hóa sự kháng nhóm C3G	TEM	F	ATAAAATTCTTGAAGACGAAA	1078
		R	GACAGTTACCAATGCTTAATC
	SHV	F	TGGTTATGCGTTATATTCGC	866
		R	GGTTAGCGTTGCCAGTGCT
	CTX-M-3	F	CCCATGGTTAAAAAATCACT	889
		R	CCGTTTCCGCTATTACAAAC
	CTX-M-9	F	ATGGTGACAAAGAGAGTGCA	868
		R	CCCTTCGGCGATGATTCTC
Nhóm gen mã hóa sự kháng nhóm Quinolon	qnr A	F	AGAGGATTTCTCACGCCAGG	577
		R	TGCCAGGCACAGATCTTGAC
	qnr B	F	GGMATHGAAATTCGCCACTG	263
		R	TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA
	qurS	F	GCAAGTTCATTGAACAGGGT	425
		R	TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 134 trang tài liệu này.

Ghi chú: F- Mồi xuôi; R: Mồi ngược

- PreMix

- Thang ADN chuẩn

* Hóa chất

- Thạch agarose dùng trong điện di gen( tự pha)

- Ethidium bromide dùng để nhuộm gen

- TAE (Tri Acetate EDTA)

* Dụng cụ máy móc phục vụ kỹ thuật PCR

- Máy ly tâm lạnh( Clinispin, Đức)

- Máy điều nhiệt tự động (Eppendorf, Đức)

- Bộ điện di ngang (Fisher scientific,USA)

- Máy chụp ảnh gel (GelDoc-lt imager, USA)

Sinh phẩm, hóa chất,dụng cụ dùng trong kỹ thuật Southern Blot

* Sinh phẩm:

- Môi trường TM,CHO hoặc canh thang BHI (tự pha)

- Enzym S1 (Của hãng Sigma)

- Lyzozyme, proteinase K (Của hãng Sigma)

- Dung dịch ly giải vi khuẩn và một số dung dịch khác (Của hãng Sigma)

* Hóa chất:

- Thạch incert agarose (cambrex Biocience, Rockland Inc. USA)

- Thạch gold agarose (cambrex Biocience, Rockland Inc. USA)

- Ethidium bromide dùng để nhuộm các đoạn ADN

- Dung dịch EDTA

- Dung dịch pett IV (tự pha với hóa chất gốc)

- Dung dịch ES(tự pha với hóa chất gốc).

- Dung dịch Tris- HCL 1M (Invitrogen.)

- Dung dịch BSA 1%

- Màng lai nitrocellulose

- Một số hóa chất khác....

* Dụng cụ, máy móc phục vụ cho kỹ thuật Southern Blot

- Dàn máy PFGE (CHEF - DRR II (Bio- rad)

- Máy chuyển ADN lên màng lai (Prehybridization)

- Máy Hybridization

2.4.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4.3.1. Lấy bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập

Mẫu bệnh phẩm để xác định căn nguyên gây NKHHCT trẻ em được lấy từ dịch tỵ hầu, dịch hút nội khí quản hoặc dịch rửa phế quản. Cách lấy bệnh phẩm được thực hiện theo thường quy của Tổ chức Y tế thế giới (WHO).

* Cách lấy bệnh phẩm tỵ hầu:

 Bệnh nhân được bế ngồi trong lòng người lớn ở tư thế khám họng ( mặt nhìn ra phía trước, đầu hơi ngả ra phía sau).

 Dùng loại tăm bông có cán được làm bằng kim loại mềm, không gỉ vào qua lỗ mũi một đoạn bằng chiều dài 1/2 từ cánh mũi đến dái tai cùng bên.

 Xoay tròn tăm bông vài lần rồi nhẹ nhàng kéo ra đưa vào tuýp có môi trường vận chuyển .

 Cắt đoạn trên của tăm bông, phần không chạm vào tuýp và đậy chặt nắp.

 Dán nhãn trên tuýp đựng mẫu bệnh phẩm.

 Hoàn thành các mẫu theo yêu cầu của phòng thí nghiệm.

* Cách lấy bệnh phẩm đường hô hấp dưới:

 Bệnh nhân được lấy dịch nội khí quản qua sonde vô trùng sau khi được đặt nội khí quản hoặc dịch rửa phế quản qua nội soi phế quản.

 Dán nhãn trên ống đựng mẫu bệnh phẩm.

 Hoàn thành các mẫu theo yêu cầu của phòng thí nghiệm.

* Vận chuyển mẫu bệnh phẩm:

 Chuyển đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt để giảm tối đa sự phát triển của vi khuẩn hội sinh .

2.4.3.2. Nuôi cấy, phân lập, xác định căn nguyên vi khuẩn:

Thực hiện theo thường quy của WHO và Viện Y học Nhiệt đới thuộc đại học Nagasaki- Nhật Bản [7], [17], [59], [79], [93], [116].

*Xử lý bệnh phẩm:

Bệnh phẩm được đưa vào ống nghiệm vô trùng chứa 1ml canh thang BHI. Dùng máy lắc trộn đều, rồi loại bỏ tăm bông. Lúc này, dung dịch bệnh phẩm đã được pha loãng 100 lần (vì bệnh phẩm lấy được bằng tăm bông tương đương 0,01 ml pha trong 1ml canh thang BHI).

* Sơ đồ2.1. Sơ đồ nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn.

*Kỹ thuật cấy đếm: dùng máy lắc trộn đều ống số 1, sau đó lấy 0,5 ml hỗn dịch trộn với 4,5 ml NaCl 0,9% ở ống số 2. Tiếp tục làm như vậy cho đến ống số 6. Tại ống số 6, sau khi đã trộn đều hỗn dịch thì bỏ đi 0,5 ml. Như vậy, bệnh phẩm đã được pha loãng thành 6 độ: 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6; 10-7.

 Từ các nồng độ pha loãng trên, dùng que cấy chuẩn lấy 1 ăng đầy

(tương đương 0,01 ml hỗn dịch) cấy lên 1/6 đĩa thạch TM,CHO được đánh số tương ứng, với lưu ý cấy từ nồng độ loãng nhất đến nồng độ đặc nhất. Chờ se mặt thạch, lật ngược đĩa thạch, để vào tủ ấm 35 - 370C trong khí thường có 5% CO2, sau 24 giờ đọc kết quả.

 Nếu sau 24 giờ, chưa thấy vi khuẩn mọc thì tiếp tục để trong điều kiện như trên, thêm 24 giờ nữa. Sau 48 giờ nuôi cấy, không thấy vi khuẩn mọc thì bệnh phẩm đó được kết luận là âm tính.

 Nếu có vi khuẩn mọc thì tiến hành đếm và tính số lượng khuẩn lạc như sau:

o Số lượng khuẩn lạc = n x 102 x nồng độ pha loãng.

o Ví dụ: ở vùng 5 số khuẩn lạc đếm được là 7, thì số lượng khuẩn lạc ở vùng 5 = 7 x102 x 106.

Ở đây x102 vì: 1 ăng chuẩn tương đương 0,01 ml. Số lượng khuẩn lạc lại được tính cho 1ml bệnh phẩm.

 Nếu ở một nồng độ lại có 2 hoặc 3 loại khuẩn lạc mọc thì cách tính số lưọng khuẩn lạc như trên (số lượng khuẩn lạc được tính cho 2 hoặc 3 loại vi khuẩn/1ml).

 Theo Oishi Nagatake và cộng sự để khẳng định căn nguyên gây NTHHCT ở trẻ nhỏ có biểu hiện lâm sàng, kết quả nuôi cấy vi khuẩn phải lớn hơn hoặc bằng 106 CFU/1ml.

* Đối với bệnh phẩm có lớn hơn hoặc bằng 106 CFU/1ml, tiến hành nhuộm Gram

và thử oxydase (âm tính) => đưa và máy định danh để có chẩn đoán xác định là Klebsiella pneumoniae.

* Định danh vi khuẩn bằng máy VITEK 2:

Trên thạch dinh dưỡng hay thạch máu, khuẩn lạc vi khuẩn cần định danh đã được nuôi cấy thuần nhất sau 18 - 24 giờ. Tiến hành nhuộm gram, soi và xác định hình thể vi khuẩn:

- Nếu là cầu trùng gram dương tiến hành thử nghiệm catalase

+ Catalase dương tính => sử dụng card định danh tụ cầu

+ Catalase âm tính =>làm thử nghiệm optochin

* Optochin dương tính => sử dụng card định danh phế cầu

* Optochin âm tính => sử dụng card định danh liên cầu

- Nếu là nấm => sử dụng card định danh nấm

- Nếu là khuẩn lạc hơi xám, chỉ mọc trên chocolate còn trên thạch máu không mọc hoặc mọc yếu, nhuộm Gram soi thấy hình ảnh trực khuẩn gram âm đa hình thái nghĩ tới Heamophilus sử dụng card NH định danh cho Heamophilus.

- Nếu là trực khuẩn gram âm sử dụng card định danh GN test kit code 21341, dựa trên 54 tính chất sinh vật hóa học cho xác định các trực khuẩn gram âm. 54 tính chất sinh vật hóa học sau để khẳng định là chủng vi khuẩn Klebsiella spp.

APPA

-	dGLU	+	BAap	-	dTAG	-	NAGA	-	CMT	-
ADO	+	GGT	+	ProA	-	dTRE	+	AGAL	+	BGUR	-
PyrA	+	OFF	+	LIP	-	CIT	+	PHOS	+	O129R	+
dCEL	+	BGLU	+	PLE	+	MNT	+	GlyA	-	GGAA	+
BGAL	+	dMAL	+	TyrA	-	5KG	-	ODC	-	IMLTa	-
H2S	-	dMAN	+	URE	-	ILATk	+	LDC	+	ELLM	-
BNAG	-	dMNE	+	dSOR	+	AGLU	-	IHISA	-	ILATa	-
AGLTp	-	BXYL	+	SAC	+	SUCT	+	BXYL		IARL	-

2.4.3.3. Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán trên thạch

+ Nguyên lý:

Các loại kháng sinh khác nhau đã được tẩm trong các khoanh giấy, sẽ khuếch tán trong thạch và kìm hãm sự phát triển của chủng vi khuẩn trên bề mặt thạch, tạo thành các vòng ức chế. Dựa vào đường kính vòng ức chế để đánh giá mức độ nhạy cảm của chủng vi khuẩn với kháng sinh tương ứng.

+ Mục đích :

Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh với các loại kháng sinh khác nhau.

* Kỹ thuật [26], [25], [43], [71], [84], [90].

- Chuẩn bị môi trường:

Môi trường MH (có thể cho thêm chất bổ sung tùy loại vi khuẩn) được chuẩn bị trong hộp lồng với độ dày 4-5mm, lưu ý khi đổ môi trường cần đặt trên một mặt phẳng, để đảm bảo độ dầy của thạch đồng đều. Môi trường đã được chuẩn‌

bị có thể bảo quản trong túi nylon kín, giữ ở 4-80C, sử dụng trong 2 tuần. Trước khi sử dụng, nên phơi trong tủ ấm 370C/15phút.

- Chuẩn bị chủng:

Vi khuẩn đã được định danh, thuần khiết, nuôi cấy 18-24h trên môi trường không có chất ức chế (tùy loại vi khuẩn sẽ cần môi trường thích hợp để phát triển tốt, xem phần 2.3.), lấy vi khuẩn hòa trong canh thang MH, nước muối sinh lý 0,9% NaCl hoặc dùng đệm PBS pH 7,2 tùy loại vi khuẩn so với độ đục chuẩn McFarland 0,5 để có huyền dịch vi khuẩn ban đầu tương ứng với 108 vi khuẩn/1ml. Sau đó tiếp tục pha loãng huyền dịch này 1/100 (hoặc 1/10 tùy theo mỗi loại vi khuẩn) trong canh thang MH hoặc nước muối sinh lý để có huyền dịch vi khuẩn 106 vi khuẩn/1ml (hoặc 107, hoặc 108 vi khuẩn/1ml, tùy theo mỗi loại vi khuẩn). Có thể tạo huyền dịch vi khuẩn bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang MH ở 370C/3-5h có lắc (nồng độ vi khuẩn này tương đương với độ đục chuẩn Mc-Farland 0,5 là 108 vi khuẩn/1ml).

* Tiêu chuẩn để đánh giá một huyền dịch vi khuẩn pha đạt chuẩn được dựa trên hình ảnh kháng sinh đồ, các khuẩn lạc đứng cạnh nhau, không chồng dày lên nhau.

- Cấy vi khuẩn:

Láng huyền dịch vi khuẩn 106 vi khuẩn/1ml (hoặc 107, hoặc 108 vi khuẩn/1ml, tùy theo loại vi khuẩn) lên bề mặt thạch, dùng pipette Pasteur loại bỏ huyền dịch vi khuẩn còn thừa ra khỏi đĩa thạch. Hoặc dùng tăm bông dàn đều vi khuẩn lên bề mặt thạch, sau đó để hộp thạch khô tự nhiên hoặc phơi trong tủ ấm 35- 370C/15-30 phút.

- Đặt khoanh giấy kháng sinh:

Dùng dụng cụ đặt khoanh giấy hoặc dùng pince kẹp để đặt khoanh giấy kháng sinh, sao cho khoảng cách giữa các khoanh giấy cách nhau 2cm và cách mép hộp lồng 2cm, hộp lồng tròn đường kính 90mm đặt tối đa 7 khoanh giấy (6 khoanh xung quanh và 1 khoanh ở giữa), hộp lồng vuông cạnh 120mm đặt tối đa 16 khoanh giấy (bốn hàng x 4 khoanh/hàng). Sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, cần để hộp lồng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi cất trong tủ ấm 35-370C (Để lật ngược nắp

hộp lồng xuống dưới, tránh hiện tượng hơi nước tích tụ rơi từ nắp hộp xuống mặt thạch đã láng vi khuẩn, làm ảnh hưởng đến kết quả).

- Đọc kết quả :

- Đọc kết quả sau khi đã để tủ ấm 35-370C/18-24h.

- Dựa vào bảng chuẩn để xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của từng loại vi khuẩn khác nhau.

- Có ba mức độ nhạy cảm được qui định: nhạy cảm(Susceptible -viết tắtS)

,trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R).

- Các chủng chuẩn được tiến hành song song với các mẫu bệnh phẩm để kiểm tra chất lượng kỹ thuật

Hình 2.1. Kháng sinh đồ trên hộp lồng vuông cạnh 120mm

2.5.3.4. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch để xác định khả năng sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL) của vi khuẩn (CLSI)

Mục đích: Xác định xem các chủng Klebsiella spp. phân lập tại Bệnh viện Nhi trung ương có sinh men β-lactamase phổ rộng không.

Nguyên lý: Nếu các chủng vi khuẩn được thử có sinh ra men β-lactamase phổ rộng, nó sẽ phân huỷ kháng sinh cefotaxim và ceftazidim, làm cho vòng vô khuẩn của các kháng sinh này giảm xuống tới mức nhạy cảm vừa (Intermidiated – I) hoặc kháng (Resistance – R). Kháng sinh augmentin (phối hợp của hai kháng sinh: amoxicillin và acid clavulanic), có chất ức chế men β-lactamase phổ rộng là axid clavulanic, nên kháng sinh amoxicillin không bị phá huỷ và có vòng vô khuẩn ở mức nhạy cảm (Sensitive – S). Đồng thời ở vùng giáp ranh giữa các kháng sinh

Xem tất cả 134 trang.

Ngày đăng: 12/11/2022