- Bộ sinh phẩm chuẩn đoán huyết thanh học vi rút viêm gan C “Monolisa anti-HCV Plus” của Bio-rad.
Trang thiết bị cần thiết: Máy đọc tấm Elisa (Imark) bước sóng 450/650nm, máy rửa tấm Elisa (PW40), máy ủ tấm 370C, máy ly tâm tuýp 1,5ml, máy lắc, pipet 100 μl, 200 μl và 1000 μl, pipet tám kênh 10-100 μl, 30- 300 μl, đầu côn các loại100 μl, 200 μl và 1000 μl.
Mẫu xét nghiệm: Kỹ thuật viên lấy máu tĩnh mạch ngoại biên các đối tượng trong điều tra huyết thanh học tại thực địa. Các mẫu máu được để đông ít nhất 15 phút, sau đó ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng đầu côn sạch hút huyết thanh vào các tuýp vô trùng bảo quản lạnh (-20°C). Mẫu huyết thanh đ- ược vận chuyển và bảo quản ở -20°C cho đến khi tiến hành các xét nghiệm chuẩn đoán. Mẫu huyết thanh được làm tan đá trước khi tiến hành các xét nghiệm. Nếu sử dụng trong vòng 3 ngày, bảo quản mẫu ở 2-8°C.
Kỹ thuật xét nghiệm
a. Xét nghiệm chuẩn đoán huyết thanh học vi rút viêm gan B bằng bộ sinh phẩm monolisa HBsAg Ultra: Đây là kỹ thuật xét nghiệm phát hiện kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg) trong mẫu huyết thanh. Kỹ thuật này sử dụng các kháng thể đơn dòng và đa dòng đặc hiệu với các subtype HBsAg khác nhau mang đột biến trên vùng gen S. Pha rắn được gắn các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với HBsAg. Kháng thể cộng hợp là các kháng thể chuột đơn dòng và dê đa dòng kháng HBsAg và được gắn với enzyme peroxidase. Nếu mẫu bệnh phẩm có kháng nguyên HBsAg thì phức hợp kháng thể - kháng nguyên – kháng thể cộng hợp sẽ hình thành và bám vào đáy giếng. Phức hợp này được phát hiện nhờ khả năng chuyển màu cơ chất Tetramethyl Benzidine của enzyme peroxidase.
b. Xét nghiệm chuẩn đoán vi rút viêm gan C bằng bộ sinh phẩm Monolisa anti-HCV Plus: Đây là kỹ thuật miễn dịch enzyme nhằm phát hiện kháng thể kháng virus viêm gan C (anti-HCV) trong huyết thanh. Kỹ thuật
này sử dụng các kháng thể đơn dòng và đa dòng đặc hiệu. Pha rắn được gắn các kháng nguyên tinh sạch là các protein tái tổ hợp được tách dòng từ vùng gen không cấu trúc và vùng tạo cấu trúc của hệ gen HCV. Kháng thể cộng hợp là các kháng thể dê kháng IgG người được gắn enzyme peroxidase. Nếu mẫu có kháng thể anti-HCV thì phức hợp kháng nguyên – kháng thể – kháng thể cộng hợp enzyme sẽ hình thành và bám vào đáy giếng. Phức hợp này đ- ược phát hiện nhờ khả năng chuyển màu cơ chất Tetramethyl Benzidine của enzyme peroxidase.
c. Xét nghiệm chuẩn đoán HIV bằng bộ sinh phẩm Genscreen Ultra HIV Ag-Ab: Đây là kĩ thuật miễn dịch enzyme kiểu “sandwich” nhằm phát hiện kháng nguyên p24 của vi rút HIV và các kháng thể kháng vi rút HIV-1 và HIV-2 trong mẫu huyết thanh. Kỹ thuật này sử dụng các kháng thể đơn dòng và đa dòng đặc hiệu. Pha rắn được phủ các kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên p24 của HIV-1.Các kháng nguyên tinh chế gồm protein tái tổ hợp gp 160 mô phỏng epitop đặc hiệu nhóm O của HIV-1 và một đoạn peptit mô phỏng epitop trên protein vỏ của HIV-2. Nếu mẫu bệnh phẩm có kháng nguyên HIV thì phức hợp Kháng thể cố định – Kháng nguyên – Kháng thể gắn biotin – Streptavidin gắn peroxidase sẽ hình thành và bám vào đáy giếng. Nếu mẫu bệnh phẩm có kháng thể kháng HIV–1 hoặc HIV–2 thì phức hợp Kháng nguyên cố định – Kháng thể – Kháng nguyên gắn peroxidase sẽ hình thành và bám vào đáy giếng. Các phức hợp này được phát hiện nhờ khả năng chuyển màu cơ chất Tetramethyl Benzidine của enzyme peroxidase.
Kiểm soát chất lượng các xét nghiệm được thực hiện với mẫu huyết
thanh kiểm tra Virotrol I (Bio-Rad).
2.3.5.2. Xét nghiệm sinh học phân tử
Vật liệu và thiết bị cần thiết:
Sinh phẩm chính
- Bộ sinh phẩm tách chiết DNA QIAamp Viral DNA mini (Qiagen,
51304)
- Bộ sinh phẩm tách chiết RNA: QIAamp Viral RNA mini (Qiagen,
52904-52906)
- Bộ sinh phẩm Abbott Realtime HCV
- Sinh phẩm Invitrogen Platinum qPCR Supermix (Invitrogen). Superscript III Platinum One-step Quantitative RT-PCR system) (Invitrogen). Sinh phẩm Expand high fidelity PCR system (Roche)
- Sinh phẩm giải trình tự: BigDye Terminator V3.1 (ABI)
- Mồi và các đầu dò đánh dấu huỳnh quang (theo bảng)
Gene đích | Reverse Transcriptase |
Phương pháp khuếch đại gene đích | Nested RT-PCR |
Trình tự mồi khuếch đại gene đích | |
PCR1: Mồi xuôi | 5’ AGACAGGYTAATTTTTTAGGGA 3’ |
PCR1: Mồi ngược | 5’ CCCACTCAGGAATCCAGGT 3’ |
PCR2: Mồi xuôi | 5’GACCTACACCTGTCAACATAATTGG 3’ |
PCR2: Mồi ngược | 5’ CTCATTCTTGCATATTTTCCTGTT 3’ |
Độ dài s/p PCR | 1.1kb |
Trình tự mồi giải trình tự | |
Mồi xuôi | 5’GACCTACACCTGTCAACATAATTGG 3’ |
Mồi xuôi | 5’ TTAAAGCCAGGAATGGATG 3’ |
Mồi ngược | 5’ CTCATTCTTGCATATTTTCCTGTT 3’ |
Mồi ngược | 5’ CTAGGTATGGTAAATGCAGT 3’ |
Chương trình phân tích trình tự | DNA Star Lasergene – Seqman |
Ngàn hàng gene | http://hivdb.stanford.edu/ |
Có thể bạn quan tâm!
-
![Các Kết Quả Khảo Sát Kiểu Gen Hbv Của Người Việt Nam [2]](https://tailieuthamkhao.com/uploads/2022/11/12/tinh-trang-nhiem-hiv-hbv-hcv-va-yeu-to-lien-quan-o-mot-so-nhom-nguy-co-cao-5-120x90.jpg)
![Các Kết Quả Khảo Sát Kiểu Gen Hbv Của Người Việt Nam [2]](data:image/svg+xml,%3Csvg%20xmlns=%22http://www.w3.org/2000/svg%22%20viewBox=%220%200%2075%2075%22%3E%3C/svg%3E)
Các Kết Quả Khảo Sát Kiểu Gen Hbv Của Người Việt Nam [2] -
![Lưu Hành Hiv Trong Pnbd Một Số Tỉnh Việt Nam [32]](https://tailieuthamkhao.com/uploads/2022/11/12/tinh-trang-nhiem-hiv-hbv-hcv-va-yeu-to-lien-quan-o-mot-so-nhom-nguy-co-cao-6-120x90.jpg)
Lưu Hành Hiv Trong Pnbd Một Số Tỉnh Việt Nam [32] -
Thiết Kế Nghiên Cứu: Nghiên Cứu Dịch Tễ Học Mô Tả Cắt Ngang -
Một Số Đặc Điểm Nhân Khẩu Học Đối Tượng Nghiên Cứu -
Chiều Hướng Đồng Nhiễm Hbv/hcv Ở Ncmt Nhiễm Hiv -
Một Số Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Khả Năng Lây Nhiễm Hiv, Hbv, Hcv
Xem toàn bộ 156 trang tài liệu này.
Gen đích | DNA polymerase |
Phương pháp khuếch đại gen đích | Nested PCR |
Trình tự mồi khuếch đại gene đích | |
PCR1: Mồi xuôi | 5’GCCTCATTTTGYGGGTCACCATA 3’ |
PCR1: Mồi ngược | 5’ TTCKTTGACADACTTTCCA 3’ |
PCR2: Mồi xuôi | 5’TTGGGGTGGAGCCCTCAGGCT 3’ |
PCR2: Mồi ngược | 5’ TTCKTTGACADACTTTCCA 3’ |
Độ dài s/p PCR | 1.13kb |
Trình tự mồi giải trình tự | |
Mồi xuôi | 5’TTGGGGTGGAGCCCTCAGGCT 3’ |
Mồi xuôi | 5’GGCACTAGTAAACTGAGCCA 3’ |
Mồi ngược | 5’ TTCKTTGACADACTTTCCA 3’ |
Mồi ngược | 5’TATCGCTGGATGTGTCTG 3’ |
Chương trình phân tích trình tự | DNA Star Lasergene – Seqman |
Ngàn hàng gene | http://hbv.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php |
Gen đích | NS5B |
PP khuếch đại gene đích | Nested RT-PCR |
Trình tự mồi khuếch đại gene đích | |
PCR1: Mồi xuôi | 5’TGG(GC)TT(CT)(GT)C(GC)TATGA(CT)AC(CT) CG(AC)G(CT)TTTGA 3’ |
PCR1: Mồi ngược | 5’A(AG)TACCT(AG)GTCATAGCCTCCGTGAA 3’ |
PCR2: Mồi xuôi | 5’ TATGATACCCGCTGCTTTGACCTCCAC 3’ |
PCR2: Mồi ngược | 5’ GTCATAGCCTCCGTGAAGGCTC 3’ |
378bp | |
Trình tự mồi giải trình tự | |
Mồi xuôi | 5’ TATGATACCCGCTGCTTTGACCTCCAC 3’ |
Mồi ngược | 5’ GTCATAGCCTCCGTGAAGGCTC 3’ |
Chương trình phân tích trình tự | DNA Star Lasergene – Seqman |
Ngân hàng gen | http://hcv.lanl.gov/content/index |
Thiết bị chính
Tủ an toàn sinh học MSC, Máy Realtime ABI 7500. Hệ thống máy đo tải lượng virus m24/Realtime m2000rt (Abbott). Máy PCR điện di, Máy chụp ảnh gel. Máy giải trình tự Genetic Analyzer 3130 (A, Bể chạy BI)
- Máy ly tâm 5415R, Tủ lạnh +4oC, Tủ lạnh -20oC, Tủ lạnh -80oC, Các
loại Micropipet 1 kênh có thể tích hút từ 0,1-10µl, 10100µl, 1001000µl.
Đo tải lượng virus:
Tải lượng virus HBV và HIV được xác định bằng kỹ thuật Realtime PCR trên hệ thống máy Realtime ABI 7500 Kỹ thuật này được cải tiến dựa trên các phương pháp đã được công bố [76], [92]. Tải lượng virus HCV được đo bằng sinh phẩm Abbott Realtime HCV trên hệ thống máy tách chiết axit nucleic m24sp và máy Realtime m2000rt.
Xác định kiểu gen virus HBV, HCV và HIV
Kiểu gen HIV, HBV, HCV được xác định thông qua việc giải trình tự đoạn gen có sự khác nhau về trình tự đặc trưng cho các kiểu gen. Giải trình tự được thực hiện với sinh phẩm BigDye terminator v3.1, trên hệ thống máy Genetic Analyzer ABI 3130, trình tự thu được sẽ được kiểm tra phân tích bằng phần mềm DNA Star Lasergene – Seqman và so sánh với các ngân hàng dữ liệu của từng loại virus để xác định kiểu gene. Cụ thể, với virus HBV, đoạn gen từ vị trí 2801- 997 có chứa gene mã hóa enzyme DNA polymerase được phân tích và so sánh với ngân hàng dữ liệu tại http://hbv.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php. Kiểu gen HCV được xác định bằng so sánh trình tự gen
NS5b với ngân hàng dữ liệu Los Alamos tạihttp://hcv.lanl.gov/content/index [170], [154], [139]. Đối với HIV, vùng gen mã hóa enzyme sao chép ngược được giải mã và so sánh với ngân hàng dữ liệu HIV tại http://hivdb.stanford.edu/ để xác đinh kiểu gene [192].
Các kỹ thuật xác định kiểu gen này áp dụng với các mẫu bệnh phẩm có tải lượng của từng loại vi rút trên 1000 bản sao/ml.
Xác định kiểu gen HIV: ARN của vi rút HIV được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm bằng bộ kit QIAamp Viral RNA mini – Qiagen. Phiên mã ngược ARN thành ADN bổ sung và khuếch đại đoạn gen RT có kích thước 1405bp bằng kỹ thuật RT-PCR, sử dụng cặp mồi PCR_F3 và PCR_R1. Hỗn hợp phản ứng cho RT-PCR như sau:
Thành phần Thể tích
2X Reaction Mix 1.2mM MgSO4
Mồi xuôi 0.3µM
Mồi ngược 0.3µM
SuperScript Enzyme Mix 0.5 µl
ARN tách chiết 5.0 µl
Tổng thể tích phản ứng 25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng RT- PCR: 50oC (30 phút); 94oC (2 phút); [94oC (15 giây), 55oC (30 giây), 68oC (2.5 phút)] x 40 chu kì; 68oC (7 phút); 4oC (∞). Dùng sản phẩm PCR vòng 1 để làm khuôn khuếch đại cả đoạn gen pol có kích thước 1585bp bằng kỹ thuật Nested PCR, sử dụng cặp mồi PCR_F2 và PCR_R2. Hỗn hợp phản ứng cho PCR vòng 2 như sau:
Thành phần Thể tích
10X PCR Buffer chứa 15mM MgCl2 1.5 mM Mg2+ Mồi xuôi 0.25µM
Mồi ngược 0.25µM
dNTPs 0.4 mM
SuperScript Enzyme Mix 2.6U
Sản phẩm PCR vòng 1 2.0 µl
Tổng thể tích phản ứng 50 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng Nested- PCR: 94oC (2 phút); [94oC (15 giây), 55oC (20 giây), 72oC (1.5 phút)] x 30 chu kì; 72oC (5 phút); 4oC (∞). Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Sản phẩm PCR sau tinh sạch được tiến hành phản ứng Cycle sequencing, sử dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Sản phẩm sau tinh
sạch được tiến hành điện di trên máy ABI 3130 để giải trình tự.
Xác định kiểu gen HCV: ARN của virus HIV được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm bằng bộ kit QIAamp Viral RNA mini – Qiagen. Tạo sản phầm cADN bằng phương pháp sao chép ngược (Reverse Transcriptase).
- Nested PCR. Hỗn hợp phản ứng cho PCR vòng 1 như sau:
Thành phần Nồng độ Thể tích
10X | 2.0 | |
dNTPs | 10 mM | 0.4 |
NS5B_F1 | 20µM | 0.3 |
NS5B_R1 | 20µM | 0.3 |
High Fidelity Enzyme | 0.3 | |
dH2O | 14.7 | |
cADN | 2 | |
Tổng thể tích phản ứng | 20 |
Chu trình nhiệt của phản ứng RT- PCR: 95oC (2 phút); [94oC (15 giây), 60oC (30 giây), 72oC (45 giây)] x 28 chu kì; 72oC (7 phút); 4oC (∞).
Hỗn hợp phản ứng cho PCR vòng 2 như sau:
Nồng độ | Thể tích | |
10X PCR Buffer | 10X | 5.0 |
dNTPs | 10 mM | 1.0 |
NS5B_F1 | 20µM | 0.75 |
NS5B_R1 | 20µM | 0.75 |
......... | 0.75 | |
dH2O | ......... | 36.75 |
PCR vòng 1 | 5 | |
Tổng thể tích phản ứng | 50 |
Chu trình nhiệt của phản ứng RT- PCR: 95oC (2 phút); [94oC (15 giây), 60oC (30 giây), 72oC (45 giây)] x 28 chu kì; 72oC (7 phút); 4oC (∞).
- Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose
- Sản phẩm PCR sau tinh sạch được tiến hành phản ứng Cycle
sequencing, sử dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing
- Sản phẩm Cycle sequencing sau tinh sạch được tiến hành điện di trên máy ABI 3130 để giải trình tự.
Xác định kiểu gen HBV: N của virus HBV được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm bằng bộ kit QIAamp Viral DNA mini – Qiagen. Nested PCR. Hỗn hợp phản ứng cho PCR vòng 1 như sau:
Thành phần Nồng độ phản ứng Thể tích 1 mẫu (µl)
35,0 | ||
dNTPs | 0,2 mM | 1,0 |
Mồi xuôi HBV P4 | 300 nM | 1,5 |
Mồi ngược HBV P5 | 300 nM | 1,5 |
Expand High Fidelity buffer 10x | 1,5mM MgCl2 | 5 |
Expand High Fidelity enzyme | 3,5 U | 1 |
ADN | 5 | |
Tổng thể tích phản ứng | 50 |
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng 1: 94oC (2 phút); [94oC (15 giây), 60oC (30 giây), 72oC (60 giây)] x 10 chu kì; ); [94oC (15 giây), 50oC (30 giây), 72oC (60 giây)] x 20 chu kì 72oC (7 phút); 4oC (∞).
Hỗn hợp phản ứng cho PCR vòng 2 như sau:
Thành phần Nồng độ phản ứng Thể tích 1 mẫu (µl) dH20 35,0