Kết Quả Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Phương Pháp Chế Biến Đến Hàm Lượng

Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và và Công nghệ Việt Nam (04/2019).

Đánh giá độc tính và khảo sát khả năng kích thích apoptosis của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180 được tiến hành tại phòng Nghiên cứu Ung thư học Thực nghiệm, Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (từ 08/2021 – 10/2021).

Quy trình chạy flow cytometry theo hướng dẫn của bộ kit Annexin V Apoptosis Detection (BD) trên máy đếm tế bào BDFACS-Lysis Của hãng BD Mỹ, được thực hiện tại Labo Sinh học phân tử - Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân Y.

Nghiên cứu độc tính cấp, bán trường diễn và các tác dụng của cao định lượng NP(H) và NP(O) trên động vật thực nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Dược lý, Viện Đào tạo Dược, Học Viện Quân y (từ 6/2019 đến 10/2020).

Tiêu bản nhuộm HE đánh giá mô bệnh học của gan, lách, thận và tiêu bản mô bệnh học khối u của chuột được tiến hành tại Bộ môn - Khoa Giải phẫu bệnh – Pháp Y - Bệnh viện 103 - Học Viện Quân y.

Sơ đồ tổng thể quá trình nghiên cứu như sau:

Rễ củ 4 năm của cây Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H.) được trồng tại Simacai, Lào Cai; các saponin phân lập được; cao chiết định lượng bào chế từ Tam thất hấp và không hấp

Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến bằng hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất

Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất

Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng sau hấp nhiệt NP(H).

Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trong các mẫu Tam thất hấp và không hấp

Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất trước và sau khi hấp ở các điều kiện

Định lượng hàm lượng saponin trong 2 mẫu cao NP(O)

và NP(H)

bằng HPLC

Đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và 2 mẫu caoNP(O)

, NP(H)

trên một số dòng tế bào ung thư người

Đánh giá khả năng gâyđộc tế bào và khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180

Nghiên cứu tác dụng ức chế phát triển u của các cao định lượng trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180

Đánh giá tác dụng của các cao định lượng lên hệ miễn dịch của chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180

Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của các cao định lượng trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG180

Xác định thời gian sống thêm của chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180

Đánh giá độc tính cấp của cao định lượng NP(H)

trên chuột nhắt trắng

Đánh giá độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H)

trên chuột cống trắng

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất

3.1.1. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trong các mẫu Tam thất hấp và không hấp

3.1.1.1. Phân lập các saponin từ rễ củ Tam thất (dược liệu không xử lý hấp)

Mẫu 400 g bột Tam thất đem chiết hồi lưu với MeOH 80% (12 L x 3 lần, 3h/lần). Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dịch chiết MeOH dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40˚C thu được cao methanol tổng (51,12 g). Cao này sau đó được hòa với 400 ml nước, sau đó lắc với n-hexan 3 lần (800ml, 600 ml, 400 ml) để loại chất béo. Gộp các phần chiết, cất lại n-hexan dưới áp suất giảm thu được phần chiết n-hexan (7,27 g). Dịch chiết sau khi loại chất béo được đem lắc tiếp với n-BuOH 3 lần (800 ml, 600 ml, 300 ml). Gộp dịch chiết n-BuOH của cả 3 lần, đem cô giảm áp tới khối lượng không đổi thu được cắn n-BuOH (P, 39,64 g). Cắn n- BuOH (P, 30 g) được hòa tan trong lượng dung môi methanol tối thiểu và tẩm với 90 g silicagel rồi làm khô dung môi trên máy cất quay chân không.

Sau khi chuẩn bị cột (cột thủy tinh cao 65 cm có đường kính 7 cm phía dưới có nhồi bông), cân 450 g silicagel (cỡ 40 – 63μm) cho vào cốc thủy tinh. Nhồi silicagel bằng phương pháp nhồi cột ướt. Thêm CHCl3 vào tạo thành một hỗn dịch, dùng đũa thủy tinh khuấy cho hết bọt khí, sau đó đưa hỗn hợp silicagel tẩm chất lên cột. Giải hấp phụ bằng hệ dung môi CHCl3 – MeOH (gradient - CHCl3 giảm dần từ 100%→30%), hứng từng 30ml bằng bình nón. Sau khi khảo sát bằng sắc kí lớp mỏng (CHCl3 – MeOH – H2O (64:32:4) đã thu được 7 nhóm phân đoạn kí hiệu P1→P7, cất quay dưới áp suất thấp ở nhiệt độ 35˚C thu được các cắn P1→P7 (bảng 3.1)

Bảng 3.1: Kết quả thu được sau khi tiến hành sắc kí cột thô của cắn n-BuOH

STT

Kí hiệu	Dải phân đoạn	Khối lượng (g)
1	P1	6 – 25	8,2
2	P2	26 – 55	8,4
3	P3	56 – 71	7,1
4	P4	72 – 89	6,5
5	P5	90 – 115	10,0
6	P6	116 – 132	6,5
7	P7	133 – 155	4,4

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.

Phân đoạn P2 (4,19 g) cô cho bay hơi hết dung môi, tiếp tục tiến hành sắc ký cột mini với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi rửa giải dichlomethan/methanol/H2O (65/35/10), sau đó kết tinh lại thu được hợp chất PN1 (152 mg). Phân đoạn P3 (3,57 g) cô cho bay hơi hết dung môi, xử lý loại màu bằng dung môi aceton, kết tinh lại thu được hợp chất PN2 (77 mg). Phân đoạn P4 (3,27 g) cô cho bay hơi hết dung môi, tiếp tục tiến hành sắc ký cột mini với chất hấp phụ silica gel RP-18, hệ dung môi rửa giải methanol/H2O (3/1), kết tinh lại thu được hợp chất PN3 (89 mg). Phân đoạn P5 (501 mg) cô cho bay hơi hết dung môi, tiếp tục tiến hành sắc ký cột mini với chất hấp phụ silica gel RP-18, hệ dung môi rửa giải methanol/H2O (3/1), kết tinh lại thu được hợp chất PN4 (135 mg).

Sơ đồ chiết tách các saponin từ Tam thất chưa hấp được trình bày ở hình 3.1.

Bột Tam thất 400g

Chiết hồi lưu 3 lần x12 lít MeOH 80%, 3h,700C

Dịch chiết MeOH

Bốc hơi dung môi, 400C, P giảm

Cắn MeOH

Phân tán/ 400mlH2O lắc với n-Hexan; n-Butanol

Cắn nHexan (7,27g)

Cắn Butanol (39,64g)

SK cột, silica gel pha thường (40-60 µm); DCM- Me 100-30%, v/v

P2 (4,19g)

P3 (3,57g)

P4 (3,27g)

P5 (0,5g)

SK cột, silica gel pha thường; DCM-Me-H2O (65:35:10, v/v)

Loại màu bằng aceton, kết tinh

SK cột silica gel pha đảo, RP18, MeOH - H2O

(3:1, v/v)

SK cột silica gel pha đảo, RP18, MeOH - H2O

(3:1, v/v)

Hợp chất 1 (152mg)

Hợp chất 2 (77mg)

Hợp chất 3 (89mg)

Hợp chất 4 (135mg)

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất 1,2,3,4 từ Tam thất không hấp

3.1.1.2. Phân lập các saponin rễ Tam thất sau khi hấp ở nhiệt độ cao

Mẫu sau khi hấp (1 mẫu, 500 g) ở nhiệt độ 120oC trong 8 h, được tiến hành chiết lấy saponin toàn phần tương tự như mục 3.1.1 thu được cao n-butanol (43,01 g, ký hiệu PB). 30,0 g cắn n-BuOH của cao chiết methanol 80% (PB) rễ Tam thất sau khi hấp được phân lập trên sắc ký cột (tiến hành tương tự mục 3.1.1) với chất hấp thụ silica gel, giải hấp phụ bằng hệ dung môi CHCl3 – MeOH (gradient - CHCl3 giảm dần từ 100%→50%), hứng từng 30 ml bằng bình nón. Sau khi khảo sát

bằng sắc kí lớp mỏng đã thu được 9 nhóm phân đoạn kí hiệu PB1→PB9, cất quay dưới áp suất thấp ở nhiệt độ 35˚C thu được các cắn PB1→PB9.

Phân đoạn PB2 (12,2 g) cô cho bay hơi hết dung môi, tiếp tục tiến hành sắc ký cột mini với chất hấp phụ silica gel, hệ dung môi rửa giải dichlomethan/methanol/H2O (64:32:4), sau đó kết tinh lại thu được hợp chất PN5 (78 mg). Phân đoạn PB4 (6,3 g) cô cho bay hơi hết dung môi, tiếp tục tiến hành sắc ký cột mini với chất hấp phụ silica gel, hệ dung môi rửa giải dichlomethan/methanol/H2O (64:32:1), sau đó kết tinh lại thu được hợp chất PN6 (85 mg).

Sơ đồ chiết tách các saponin từ Tam thất hấp được trình bày ở hình 3.2.

Củ Tam thất (500g)

Bột Tam thất

Dịch chiết MeOH

Cắn MeOH

Hấp 1200C, 8h, sấy khô, nghiền mịn

Chiết hồi lưu 3 lần x12 lít MeOH 80%, 3h,700C

Bốc hơi dung môi, 400C, P giảm

Phân tán/ 400mlH2O lắc với n-Hexan; n-Butanol

Cắn n-Hexan

Cắn n-Butanol (43.01g)

SK cột, silica gel pha thường (40-60 µm);

DCM-Me 100-50%, v/v

P2 (12,2g) P4 (6,3g)

SK cột, silica gel pha thường; DCM-Me- H2O (64:32:4, v/v)

SK cột, silica gel pha thường; DCM-Me- H2O (64:32:1, v/v)

Hợp chất 5 (78mg)

Hợp chất 6 (85mg)

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất 5,6 từ Tam thất hấp nóng

3.1.1.3. Đặc trưng vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất phân lập được

Hình dạng, tính chất vật lý, dữ kiện phổ khối, phổ NMR của các hợp chất phân lập được chi tiết như trong bảng 3.2 và 3.3, 3.4.

Bảng 3.2. Một số tính chất vật lý, dữ kiện phổ khối của các hợp chất PN1-PN6

PN1 Ginsenosid Rg1	PN2 Ginsenosid Re	PN3 Ginsenosid Rd	PN4 Ginsenosid Rb1	PN5 Ginsenosid Rg3	PN6 Ginsenosid Rh1
Hình dạng	Bột màu trắng (H2O-MeOH)	Bột màu trắng (H2O-MeOH)	Bột màu trắng (H2O-MeOH)	Bột màu trắng (H2O-MeOH)	Bột màu trắng (H2O-MeOH)	Bột màu trắng (H2O-MeOH)
Đ.n.c (°C)	194–196	201-203	182-183	170-171	236-238	190–192
ESI-MS (m/z)	823.6 [M+Na]+ C42H72O14	969.7 [M+Na]+ C48H82O18	983.4 [M+2H2O+H]+ C48H82O18	1132.2 [M+Na]+ C54H92O23	789.6 [M+5H]5+ C42H72O13	657.4 [M+H2O+H]+ C36H62O9

Bảng 3.3. Dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của các hợp chất PN1, PN2, PN6

Vị trí C

PN1		PN2			PN6
13C-NMR	1H-NMR	TLTK [14]	13C-NMR	1H-NMR	13C-NMR	1H-NMR
1	40,2	1,09 (1H) 1,76 (1H)	38,44	40,3	1,09(1H) 1,75 (1H)	40,2	1,07(1H) 1,75 (1H)
2	27,6	1,61 (1H) 1,66 (1H)	26,59	27,5	1,62 (1H) 1,67 (1H)	27,6	1,61 (1H) 1,66 (1H)
3	79,9	3,14 (1H)	77,08	79,8	3,15 (1H, dd, 4,5, 11,5 Hz)	79,9	3,12 (1H, dd, J=4,5; 11,5 Hz)
4	40,5		38,70	40,4		40,5
5	61,8	1,15 (brs)	59,89	61,5	1,14 (brs)	61,8	1,14(brs)