Đánh Giá Tác Dụng Của Các Cao Định Lượng Np(H) Và Np(O) Lên Hệ Miễn Dịch

- Lô 3 - Letinan (LTN): chuột gây u, uống Lentinan liều 240 mg/kg/ngày.

- Lô 4 - NP(O)-1: chuột gây u, uống NP(O) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 5 - NP(O)-2: chuột gây u, uống NP(O) liều 900 mg/kg/ngày.

- Lô 6 - NP(H)-1: chuột gây u, uống NP(H) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 7 - NP(H)-2: chuột gây u, uống NP(H) liều 900 mg/kg/ngày.

Chế phẩm NP(O), NP(H), Lentinan và nước muối sinh lý được cho chuột uống (theo phân lô) từ ngày thứ 6 kể từ khi tiêm tế bào sarcoma TG180, và cho uống liên tục trong 16 ngày.

Đánh giá tác dụng ức chế khối u dựa trên các chỉ tiêu:

- Quan sát các biểu hiện, hoạt động, tập tính ăn uống vận động của chuột.

- Cân chuột để đánh giá tình trạng cân nặng của chuột.

- Thể tích khối u: Đo kích thước khối u bằng thước kẹp Caliper, xác định đường kính lớn nhất và đường kính nhỏ nhất của khối u (Hình 2.7). Tính thể tích khối u rắn theo công thức của Bagley và cộng sự [119]: V= 0,52.a2.b.

Trong đó: a: đường kính nhỏ nhất của khối u (mm); b: đường kính lớn nhất của khối u (mm); V: thể tích khối u (mm3).

Hình 2.7. Khối u

ở đùi chuột tạo ra

dòng tế bào ung thư sarcoma TG180.

sau cấy ghép

(A) Đo kích thước khối u bằng thước kẹp; (B) Khối u ở chuột; và (C) khối u được mổ ra từ đùi chuột.

- Vào thời điểm kết thúc thí nghiệm, phẫu tích bóc tách lấy khối u khỏi đùi chuột, cân bằng cân phân tích 10-4 để xác định cân nặng khối u (W). Làm tiêu bản nhuộm HE ngẫu nhiên 4 khối u bóc tách từ 4 chuột ở mỗi lô để đánh giá. Tiêu bản mô bệnh học khối u chuột được thực hiện và đọc tại Bộ môn - Khoa Giải phẫu bệnh – Pháp y, bệnh viện 103.

- Đánh giá hiệu lực kháng u theo tiêu chuẩn của Itokawa và cộng sự [120]:

+ Xác định tỷ số phát triển khối u (GR-Growth Ratio):

GR (%) = V(W) nghiên cứu/V(W) đối chứng x 100 (%)

+ Xác định tỷ số ức chế khối u (IR-Inhibition Ratio): IR (%) = 100% - GR(%)

Hiệu lực kháng u được đánh giá theo thang đánh giá của H. Itokawa

Bảng 2.3. Thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa

IR (%)

Hiệu lực kháng u
0 – 30	-
31 – 60	+
61 – 90	++
91 – 100	+++

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.

2.2.2.4. Đánh giá tác dụng của các cao định lượng NP(H) và NP(O) lên hệ miễn dịch của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180.

Tác dụng tăng cường miễn dịch của Tam thất được xem là một trong những cơ chế tác dụng trong điều trị ung thư [76], [77]. Để đánh giá tác dụng của các cao định lượng NP(H) và NP(O) lên hệ miễn dịch gắn liền với vai trò trong điều trị ung thư,nghiên cứu tiến hành đánh giá trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG180, là mô hình gây ung thư trên chuột còn hệ miễn dịch đầy đủ. Thử nghiệm được thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Stefanova T.H. [121].

Chuột gây u bằng cách tiêm vào dưới da đùi tế bào sarcoma TG180 như mô tả ở phần 2.2.2.3. Các chuột gây u thành công được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, thêm 01 lô chuột không gây u, tổng cộng có 7 lô chuột nghiên cứu, mỗi lô 10 con.

- Lô 1 - chứng sinh lý (SL): chuột không gây u, uống nước muối sinh lý 0,3 ml/20g.

- Lô 2 - ung thư (UT): chuột gây u, uống nước muối sinh lý 0,3 ml/20g.

- Lô 3 - Letinan (LTN): chuột gây u, uống Lentinan liều 240 mg/kg/ngày.

- Lô 4 - NP(O)-1: chuột gây u, uống NP(O) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 5 - NP(O)-2: chuột gây u, uống NP(O) liều 900 mg/kg/ngày.

- Lô 6 - NP(H)-1: chuột gây u, uống NP(H) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 7 - NP(H)-2: chuột gây u, uống NP(H) liều 900 mg/kg/ngày.

Chế phẩm NP(O), NP(H), Lentinan và nước muối sinh lý được cho chuột uống (theo phân lô) từ ngày thứ 6 kể từ khi tiêm tế bào sarcoma TG180, và cho uống liên tục trong 16 ngày. Vào thời điểm kết thúc thí nghiệm, tiến hành lấy mẫu để đánh giá các chỉ số nghiên cứu.

- Lấy máu ở xoang mạch dưới hốc mắt (Orbital Sinus) của chuột bằng kỹ thuật retro-orbital blood collection [122] để định lượng IL-2, TNF-α và xét nghiệm các chỉ số huyết học. Định lượng IL-2, TNF-α bằng kỹ thuật ELISA, sử dụng kít định lượng IL-2 (mã: RAB0287-1KT), TNF-α (mã: REF KMC3011) cho chuột của hãng Invitrogen (Mỹ), tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các chỉ số huyết học được xét nghiệm bằng máy xét nghiệm huyết học Vet abcTM Animal Blood Counter của hãng ABX-Diagnostic (Pháp), với phần mềm xét nghiệm sử dụng cho chuột.

- Sau khi lấy máu, chuột được giết bằng cách làm lệch đốt sống cổ. Bộc lộ lách, tuyến ức, lọc sạch các tổ chức xung quanh, dùng gạc thấm khô rồi đem cân. Ghi lại trọng lượng lách, tuyến ức của từng chuột. Tính trọng lượng tương đối của lách (TLTĐL) và trọng lượng tuyến ức tương đối (TLTĐTƯ) (được tính là trọng lượng lách, tuyến ức ứng với 100g thể trọng chuột).

2.2.2.5. Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của các cao định lượng NP(H) và NP(O) trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG180.

Chống oxy hóa cũng được xem là một trong những cơ chế tác dụng trong điều trị ung thư. Nhiều dược liệu cũng như hoạt chất tổng hợp có tác dụng chống oxy hóa được nghiên cứu về tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư thông qua việc triển khai đánh giá về tác dụng chống oxy hóa trên chuột mang khối u, chuột được xạ trị hoặc hóa trị [41], [42], [43]. Với mục tiêu nghiên cứu liên quan tới tác dụng kháng u thực nghiệm, tác dụng chống oxy hoá của các cao định lượng NP(H) và NP(O) được đánh giá trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. Thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp được mô tả bởi Zhao và cộng sự [79].

- Lô 1 - chứng sinh lý (SL): chuột không gây u, uống nước muối sinh lý 0,3 ml/20g.

- Lô 2 - ung thư (UT): chuột gây u, uống nước muối sinh lý 0,3 ml/20g.

- Lô 3 - Letinan (LTN): chuột gây u, uống Lentinan liều 240 mg/kg/ngày.

- Lô 4 - NP(O)-1: chuột gây u, uống NP(O) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 5 - NP(O)-2: chuột gây u, uống NP(O) liều 900 mg/kg/ngày.

- Lô 6 - NP(H)-1: chuột gây u, uống NP(H) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 7 - NP(H)-2: chuột gây u, uống NP(H) liều 900 mg/kg/ngày.

- Lấy máu ở xoang mạch dưới hốc mắt (Orbital Sinus) của chuột bằng kỹ thuật retro-orbital blood collection [122] để định lượng men gan AST (Aspartate transaminase) và ALT (Alanine transaminase).

- Sau khi lấy máu, chuột được giết bằng làm lệch đốt sống cổ. Phẫu tích lấy gan, lọc sạch các tổ chức xung quanh, dùng gạc thấm khô rồi đem cân. Một phần được cắt riêng, cố định trong đệm formalin trung tính 10% để làm tiêu bản nhuộm HE. Một phần gan được cân và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm potassium phosphate (50 mM, pH 7,5) để được dịch đồng thể 10%. Dịch đồng thể được li tâm 1500 g trong 10 phút ở 40C, thu lấy phần nổi, định lượng MDA, SOD, GSH và CAT, sử dụng bộ kit xét nghiệm của hãng Sigma, Hoa kỳ .

2.2.2.6. Xác định thời gian sống thêm của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180.

Hiệu quả điều trị ung thư, ngoài cải thiện các triệu chứng bệnh, một chỉ số rất quan trọng đó là thời gian sống thêm, là kết quả đạt được của tổng hòa các tác dụng của chế phẩm nghiên cứu trên cơ thể sinh học mang khối ung thư.

Chuột gây u bằng cách tiêm vào dưới da đùi tế bào sarcoma TG180 như mô tả ở phần 2.2.2.3. Các chuột gây u thành công được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 20 con. Trong đó:

- Lô 1 - ung thư (UT): chuột được cấy truyền tế bào Sarcoma TG180 nhưng không được điều trị, uống nước muối sinh lý 0,3 ml/20g.

- Lô 2 - Letinan (LTN): chuột được cấy truyền tế bào Sarcoma TG180, uống Letinan liều 240 mg/kg/ngày.

- Lô 3 - NP(O)-1: chuột được cấy truyền tế bào tế bào Sarcoma TG180, uống NP(O) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 4 - NP(O)-2: chuột được cấy truyền tế bào tế bào Sarcoma TG180, uống NP(O) liều 900 mg/kg/ngày.

- Lô 5 - NP(H)-1: chuột được cấy truyền tế bào tế bào Sarcoma TG180, uống NP(H) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 6 - NP(H)-2: chuột được cấy truyền tế bào tế bào Sarcoma TG180, uống NP(H) liều 900 mg/kg/ngày.

Chế phẩm NP(O), NP(H), Letinan và nước muối sinh lý được cho chuột uống (theo phân lô) từ ngày thứ 6 kể từ khi cấy truyền thành công tế bào ung thư Sarcoma TG180.

Các chuột tiếp tục được nuôi dưỡng, chăm sóc và theo dõi hằng ngày đến khi chuột chết, tính trung bình thời gian sống của mỗi lô, xác định % thời gian sống kéo dài thêm theo phương pháp của Geran và cộng sự [123].

- 1 x 100 (%)

ILS (%) =

Trong đó:

Ts: thời gian sống trung bình của lô chuột ung thư có điều trị. Cs: thời gian sống trung bình của lô chuột ung thư không điều trị ILS: thời gian sống tăng thêm (Increased Life Span)

2.2.3. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H).

2.2.3.1. Đánh giá độc tính cấp của cao định lượng NP(H) trên chuột nhắt trắng

Xác định độc tính cấp (LD50) của NP(H) trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam và WHO [124], [125].

Trước khi làm thí nghiệm, NP(H) được pha ở các mức nồng độ tăng dần, xác định các mức thể tích tối đa có thể đưa vào dạ dày chuột trong một lần và trong 24h bằng kim cong tày đầu do Nhật Bản sản xuất.

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Từng lô chuột nhắt trắng, mỗi lô 10 con, được uống mẫu nghiên cứu theo liều tăng dần. Tìm liều cao nhất không gây chết chuột (0%), liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn (100%) và các liều trung gian. Theo dõi tình trạng chung của chuột (hoạt động, ăn uống, bài tiết …) và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong vòng 72 giờ sau khi cho chuột uống thuốc và tiếp tục theo dõi tiếp trong vòng 14 ngày. Xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của mẫu thử (nếu có).

2.2.3.2. Đánh giá độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H) trên chuột cống trắng.

Căn cứ vào số liệu vừa thu được về liều thử độc tính cấp và các quy định, hướng dẫn của Bộ y tế Việt Nam và của Tổ chức Y tế Thế giới, chúng tôi xây dựng các mức liều để khảo sát độc tính bán trường diễn thực nghiệm [124], [125].

Độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H) được đánh giá trên chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống. Tất cả các chuột mỗi giống được chia ngẫu nhiên vào 3 lô, mỗi lô 10 con.

- Lô 1: lô chứng sinh lý, uống nước cất với lượng 4 ml/kg.

- Lô 2: uống NP(H) liều 200mg/kg/ngày.

- Lô 3: uống NP(H) liều 900mg/kg/ngày.

Chuột được uống nước cất (lô chứng 1) hoặc mẫu nghiên cứu (lô 2, 3) một lần/ngày vào buổi sáng, uống liên tục trong 90 ngày.

- Chỉ tiêu đánh giá:

Thể trạng chung của chuột, các dấu hiệu ngộ độc được theo dõi trong suốt thời gian nghiên cứu, ít nhất 2 lần/ngày, đầu buổi sáng và cuối buổi chiều. Trọng lượng chuột được cân để đánh giá tại các thời điểm xuất phát, ngày thứ 30, 60 và 90.

Chuột được nhịn ăn qua đêm trước khi lấy máu xét nghiệm. Các mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch đuôi chuột (có hoặc không chống đông, tùy theo từng yêu cầu của loại xét nghiệm), vào các thời điểm: ngày thứ 0, 45 và 90 ở tất cả các lô. Các chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu- RBC; hematocrit- HCT, hemoglobin- HBG, thể tích trung bình hồng cầu-MCV, số lượng bạch cầu- WBC, công thức bạch cầu, và số lượng tiểu cầu- PLT) được phân tích trên máy xét nghiệm huyết học Vet abcTMAnimal Blood Counter (hãng ABX-Diagnostic, Pháp) với phần mềm xét nghiệm cho chuột, sử dụng bộ hóa hóa chất xét nghiệm huyết học ABX Minidil LMG cho chuột (hãng ABX). Các chỉ số sinh hóa (triglycerid, cholesterol, alanin aminotransferase- ALT, aspartattransaminase- AST, creatinin, albumin) được phân tích trên máy xét nghiệm sinh hóa 3000 Evolution (hãng Biochemical

SystemsInternational, Ý), sử dụng các kit xét nghiệm của hãng Hospitex Diagnosics, Ý và hãng Dialab GmbH, Áo.

Sau khi lấy máu vào cuối thời điểm ngày thứ 90, động vật được giết và phẫu tích để đánh giá đại thể và làm tiêu bản nhuộm HE đánh giá vi thể mô gan, lách, thận của ngẫu nhiên 30% số chuột ở mỗi lô.

2.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU

* Số liệu về chuột sống sót tích lũy theo thời gian được biểu thị bằng đường cong sống sót Kaplan–Meier, vẽ bằng phần mềm PRISM. So sánh thời gian sống sót tích lũy giữa các lô sử dụng Log-rank (Mantel–Cox) test. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

* Các số liệu khác được trình bày dưới dạng giá trị trung bình (Mean) ± SD, sử dụng thuật toán thống kê thích hợp với số liệu thu được, cụ thể như sau:

- So sánh sự khác biệt về giá trị trung bình giữa các lô sử dụng phân tích phương sai 1 chiều (One-way ANOVA) và Post Hoc least- significant differences (LSD) test với trường hợp phương sai đồng nhất, sử dụng One-way ANOVA và Dunnett’s T3 test với trường hợp phương sai không đồng nhất.

- So sánh sự khác biệt về giá trị trung bình giữa các thời điểm nghiên cứu trong cùng một lô sử dụng phép so sánh theo cặp (Paired sample T test).

Các kết quả xử lý thống kê được tính toán trên phần mềm IBM SPSS Statistics 20.0. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

2.4. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các phương pháp chế biến Tam thất (hấp hoặc không hấp nhiệt) đến hàm lượng saponin của Tam thất trồng tại Việt Nam được tiến hành tại khoa Hoá phân tích- tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, Bộ Y tế và đo phổ tại Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và và Công nghệ Việt Nam từ tháng 12 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017.

Đánh giá tác dụng kháng ung thư của 6 saponin đã phân lập và cao định

lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư ngườiđược tiến hành tại