Thiết Bị, Dụng Cụ, Hóa Chất Sử Dụngtrong Nghiên Cứu

Hình 2.4: Mẫu Tam thất tươi, hấp ở 120ºC

* Cao định lượng NP(O) và NP(H)

Cân khoảng 1 kg bột Tam thất, chiết hồi lưu với dung môi ethanol 70%, tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1 (thể tích/khối lượng), 3 lần, mỗi lần 3 giờ. Gộp các dịch chiết, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc.

Hiệu suất chiết cao đặc từ bột Tam thất được xác định dựa trên công thức:

Mcao x (100-acao) x 100 H=

Mdl x (100-adl)

Trong đó: H: hiệu suất chiết cao (%)

Mcao, Mdl: khối lượng cao, khối lượng dược liệu (g) acao, adl: độ ẩm cao, độ ẩm dược liệu (%)

Có thể bạn quan tâm!

• Một Số Hình Ảnh Về Tam Thất Lào Cai (Tự Chụp)
• Tổng Quan Về Các Mô Hình Thực Nghiệm Đánh Giá Tác Dụng Kháng U
• Chất Liệu Và Đối Tượng Nghiên Cứu
• Định Lượng Hàm Lượng Saponin Trong 2 Mẫu Cao Np(O) Và Np(H) Bằng Hplc
• Đánh Giá Tác Dụng Của Các Cao Định Lượng Np(H) Và Np(O) Lên Hệ Miễn Dịch Của Chuột Mang Khối U Rắn Sarcoma Tg180.
• Kết Quả Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Phương Pháp Chế Biến Đến Hàm Lượng Saponin Của Rễ Củ Tam Thất

Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.

- Cao định lượng từ bột rễ củ Tam thất không hấp được ký hiệu là NP(O).

- Cao định lượng từ bột rễ củ Tam thất hấp được ký hiệu là NP(H).

NP(O)

NP(H)

Hình 2.5. Cao định lượng NP(O) và cao định lượng NP(H)

* Các saponin đã phân lập:

- 2 saponin Rg3 và Rh1 thu được từ rễ củ Tam thất đã hấp hơi nóng;

- 4 saponin Rg1, Re, Rd và Rb1 thu được từ rễ củ Tam thất chưa xử lý qua hơi nóng;

Hình 2.6. Các saponin phân lập từ Tam thất

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

- Các dòng tế bào ung thư người: ung thư ruột kết (HT29), ung thư tế bào gan (HepG2), ung thư vú (MCF-7), ung thư cơ (RD), ung thư biểu mô đáy phế nang phổi (A549), ung thư biểu mô tuyến phổi (SK-LU-1): (ATCC, Hoa Kỳ), được bảo quản tại Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.

- Dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột Sarcoma TG180:(ATCC, Hoa Kỳ), được bảo quản tại Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, cân nặng từ 20 - 22 gam, do Học viện Quân y cung cấp,dùng trong nghiên cứu độc tính cấp và nghiên cứu tác dụng kháng u đùi thực nghiệm.

- Chuột cống trắng trưởng thành, dòng Wistar, không phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, cân nặng 180 - 220g, do Học viện Quân y cung cấp, dùng trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn.

Chuột được nuôi 7- 14 ngày để thích nghi với môi trường và điều kiện chăn nuôi của phòng thí nghiệm trước khi tiến hành nghiên cứu. Nhiệt độ phòng nuôi 25

± 50C. Động vật được ăn thức ăn dạng viên và uống nước sạch, tự do (ad libitum).

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụngtrong nghiên cứu

2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

* Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất

- Các dụng cụ dùng trong quá trình thực nghiệm như bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm.

- Cột sắc ký các kích thước.

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI).

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.

- Bếp điện, bếp đun cách thủy.

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa HA60.

- Đèn UV-Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.

- Máy scan CanoScan LiDe 100 (Trung Quốc).

- Máy siêu âm Power sonic 405 (Hàn Quốc).

- Máy UV-VIS 1800 dải đo 190nm-800nm, hãng Shimadzu-Nhật Bản; Máy đo điểm chảy Kofler micro-hotstage, Viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VHLKH&CNVN).

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): BRUKER AVANCE AM500 FT – NMR (Công ty Bruker, Billerica, MA, Mỹ), và BRUKER – DRX-300 (Công ty Bruker, Billerica, MA, Mỹ), của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chất nội chuẩn là tetramethyl silan.

- Máy đo phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization MassSpectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap (Mỹ) của Viện Hoá các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Máy UV-VIS 1800 dải đo 190nm- 800nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích Shimadzu LC10 TVP, detector diod array SPD-M10Avp (Nhật Bản).

- Nồi hầm hơi nước OCOO OC-8000RV (Hàn Quốc)

* Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm, độc tính cấp và bán trường diễn của các mẫu thử

- Buồng đếm tế bàoMalassez, Pháp.

- Máy đọc Elisa (SpectraMAX Plus 384 - Mỹ)

- Máy đếm tế bào BDFACS-Lysis của hãng BD - Mỹ

- Đĩa nuôi cấy tế bào 35, 100 mm; Chai nuôi cấy tế bào T25 (Corning, Mỹ).

- Hệ thống phòng thí nghiệm phục vụ nuôi cấy TB: phòng sạch, tủ ấm CO2, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm, tủ mát 40C, tủ âm -200C, -800C, bình chứa nitơ lỏng…

- Máy xét nghiệm huyết học Vet abcTM Animal Blood Counter của hãng ABX-Diagnostic (Pháp).

- Máy xét nghiệm sinh hóa 3000 Evolution (Biochemical Systems International, Ý).

- Kính hiển vi huỳnh quang Nikon Eclipse Ti2 (Nhật Bản).

- Máy nhuộm tiêu bản tự động Leica Autostainer XL- ST5010, Đức.

- Máy đọc đĩa ELISA Chromate 4300, Awareness Technology, Mỹ.

- Máy rửa tự động Stat Fax- 2600®, Awareness Technology, Mỹ.

- Máy ủ và lắc trộn Stat Fax- 2200, Awareness Technology, Mỹ.

- Kính hiển vi phẫu thuật đa năng YSX- 107; Richy- Trung Quốc.

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R; Hettich- Đức.

- Máy nghiền mô-tế bào-Homogenizer-D160-DLAB ( Mỹ).

- Tủ ấm Memmert INB 500; Memmert- Đức.

- Cân phân tích Ohaus PA 214C (d = 0,0001 g); Ohaus (Mỹ), Sartorius (Đức).

- Dụng cụ cho động vật uống thuốc (kim cong đầu tù các cỡ).

- Micropipet các cỡ, đầu côn, ống falcon các loại.

- Thước kẹp caliper dùng đo kích thước khối u đùi chuột.

- Dụng cụ phẫu thuật các cỡ, kim tiêm, chỉ, dao, kéo… và một số dụng cụ, máy móc chuyên dụng khác.

2.1.3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

* Dung môi, hóa chất dùng trong chiết xuất và phân lập: Methanol (MeOH), ethanol, n-hexan, aceton, dicloromethan (DCM), chloroform, ethyl acetat (EtOAc), n-butanol (n-BuOH)…và các thuốc thử.

* Dung môi, hóa chất dùng trong định lượng:

- Acetonitril (Merck), methanol (Merck), acid phosphoric (Merck)

- Silica gel cho sắc ký cột (0,04-0,063 mm, Merck)

- Bản mỏng silica gel tráng sẵn (MERCK): Pha thuận (Silica gel 60 F254) và pha đảo (Silica gel 60 RP-18 F254 s) hoạt hóa trong tủ sấy ở nhiệt độ 105-110°C trong 60 phút.

* Dung môi hóa chất dùng trong nghiên cứu in vitro, in vivo:

- Trichloracetic acid - TCA (Sigma), Sulforhodamine B - (Sigma).

- Thuốc tham chiếu: Lentinan (Carbosynth Limited., Anh; Batch: FL 333211401), Mã sản phẩm FL33321; CAS No.37339-90-5), sử dụng làm chất tham chiếu trong nghiên cứu in vivo.

- Chất tham chiếu: Ellipticine (Sigma – Mỹ), sử dụng làm chất tham chiếu cho thử nghiệm đánh giá tác dụng kháng ung thư của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người.

- Chất tham chiếu: Taxol (Sigma – Mỹ), sử dụng làm chất tham chiếu cho thử nghiệm đánh giá tác dụng độc tính của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180.

- Kit định lượng các chỉ số hóa sinh trong máu: ALT, AST, Albumin, Cholesterol, Bilirubin, Creatinin của hãng Hospitex Diagnosics (Italy) và hãng Dialab GmbH (Áo).

- Dung dịch xét nghiệm huyết học ABX Minidil LMG cho chuột của hãng ABX – Diagnostics.

- Kít định lượng IL-2 (mã: RAB0287-1KT), TNF-α (mã: REF KMC3011)

cho chuột của hãng Invitrogen (Mỹ).

- Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (Gibco, Mỹ), PBS (Phosphate Buffered Saline) (Gibco, Mỹ), Trypsin – EDTA (Gibco, Mỹ), FBS (Fetal Bovine Serum) (Invitrogen, Mỹ).

- Blue Trypan (Gibco, Mỹ).

- DMSO (Dimethyl Sulfoxide) (Prolabo, Mỹ).

- CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Mỹ)

- Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến bằng hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất.

2.2.1.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trongcác mẫu Tam thất hấp và không hấp.

* Phương pháp chiết xuất

Củ Tam thất (khô, đã nghiền bột) được chiết 3 lần với methanol 80% bằng phương pháp chiết nóng ở nhiệt độ sôi. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 45-50oC thu được cao đặc. Cao đặc này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng dùng cho nghiên cứu phân lập và tinh chế các chất.

* Phương pháp phân lập các chất

- Phân lập các hợp chất trong củ Tam thất bằng sắc ký cột (CC), theo dõi các phân đoạn sắc ký bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM).

- Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040- 0,063mm, Merck) với các hệ dung môi thích hợp.

- SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck, ký hiệu 105715) và RP18 (Merck). Phát hiện chất dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.

- Kết tinh lại trong hệ dung môi.

- Độ tinh khiết của các chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, nhận biết bằng đèn tử ngoại, phun dung dịch H2SO4 10% - hơ nóng, đo điểm chảy.

* Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên tính chất cảm quan, các thông số vật lý (nhiệt độ nóng chảy) và các phương pháp phổ bao gồm: phổ khối lượng (APCI-MS hoặc ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều

(1H, 13C và DEPT, HMBC, COSY…) và so sánh dữ liệu phổ thu được với các dữ liệu phổ đã công bố.

- So sánh SKLM với chất đối chiếu trong cùng điều kiện.

2.2.1.2. Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất trước và sau khi hấp ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Hàm lượng hoạt chất trong Tam thất trước và sau khi hấp ở các điều kiện khác nhau được đánh giá bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Các yếu tố được khảo sát là thời gian hấp (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24h), nhiệt độ hấp (1000C, 1200C), mẫu Tam thất tươi hoặc khô [115].

Các chất đối chiếu là các chất tinh khiết đã được chiết xuất và phân lập từ mẫu nghiên cứu (mục 3.1.1). Phương pháp định lượng được tham khảo tài liệu của Dong Wang và cộng sự có điều chỉnh cho phù hợp với mẫu nghiên cứu [116].

Chuẩn bị mẫu:

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 15,0 mg mỗi chất đối chiếu, hòa tan riêng trong 5ml methanol, thu được các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 3mg/ml. Phối hợp các dung dịch chuẩn gốc thu được dung dịch hỗn hợp chuẩn. Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn với methanol, thu được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ thích hợp.

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,0 g bột dược liệu, cho vào bình nón, thêm 100ml dung môi methanol. Chiết hồi lưu trong 2 giờ. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình định mức 100ml, thêm dung môi đến vạch thu được dung dịch thử.

Các dung dịch chuẩn và dung dịch thử được lọc qua màng lọc kích thước 0,45µm trước khi triển khai sắc ký.

Điều kiện sắc ký:

Hệ thống HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản Nhiệt độ buồng cột: 28°C

Tốc độ dòng: 1,0ml/phút