Các Hợp Chất Phân Lập Từ Thân Rễ Tam Thất (Pn1, Pn2, Pn6) Và Phổ Hmbc Chọn

hợp với công thức phân tử dự đoán. Với các phân tích cụ thể về tương tác HMBC (Hình 3.3) kết hợp tham khảo tài liệu [128] cho phép đưa ra cấu trúc của PN1 là {6- O-[β-D-glucopyranoside]-20-O-[β-D-glucopyranosyl]- 3β,6α,12β, 20S- Tetrahydroxydammar-24-en} hay ginsenosid Rg1.

*Hợp chất PN2

Phổ NMR của hợp chất PN2 cho các pic cộng hưởng có độ chuyển dịch giống như của hợp chất PN1 (xem bảng 3.3), thêm vào đó là các pic cộng hưởng của một vòng đường rhamnose đặc trưng bởi tín hiệu proton methyl δ 1,25 (3H, d, J

= 6,0 Hz, H-6′′′), anomer δ 5,33 (1H, s, H-1′′′) cùng tín hiệu của 6 carbon δ 101,6 (C-1′′′), 72,5 (C-2′′′), 72,2 (C-3′′′), 74,9 (C-4′′′), 69,7 (C-5′′′), 18,0 (C-6′′′). Đường

này liên kết với đường glucose trong PN1 tại vị trí 2′ thông qua liên kết HMBC giữa H1′′′ (δ 5,33) và C-2′ (δ 79,1).

Phổ khối phun mù điện tử của hợp chất PN2 xuất hiện pic ion 969.7 [M+Na]+ tương ứng khối lượng phân tử M = 946 đvC phù hợp với công thức phân tử là C48H82O18

Từ các dữ kiện phổ được dẫn ra tại bảng 3.3 kết hợp tài liệu tham khảo [129] có thể kết luận hợp chất PN2 là {6-O-[β-D-glucopyranosyl (1→2)-(α-L-rhamnopyranosyl)]-20-O- [β-D-glucopyranosyl]- 3β,6α,12β, 20S-tetrahydroxydammar-24-ene} hay ginsenosid Re.

*Hợp chất PN6

Hợp chất PN6 có phổ của phần aglycon tương tự như phổ của hợp chất PN1 và PN2, điều khác biệt ở đây là số lượng các phân tử đường. Ở hợp chất PN6, chỉ xuất hiện duy nhất tín hiệu của một đường glucose liên kết với phần aglycon ở vị trí carbon số 6. Điều này có thể thấy rõ qua kết quả phổ khối lượng với píc ion m/z (positive) ở 657.4 [M+H2O+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M = 638 đvC, phù hợp với công thức phân tử C36H62O9. Kết hợp với việc phân tích các dữ kiện phổ 1H, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và tài liệu tham khảo [130] cho phép kết

luận về cấu trúc của hợp chất PN6 là 6-O-[β-D-glucopyranosyl-3β,6α,12β,20S- tetrahydroxydammar-24-ene} hay ginsenosid Rh1.

Hình 3.3. Các hợp chất phân lập từ thân rễ Tam thất (PN1, PN2, PN6) và phổ HMBC chọn lọc của hợp chất PN1

* Hợp chất PN3

Cũng như các hợp chất PN1, PN2, PN6, phổ cộng hưởng từ 1D-NMR của hợp chất PN3, PN4, PN5 cũng cho những nét đặc trưng của saponin với phần aglycon khung dammaran liên kết với các phân tử đường.

Trên phổ 1H-NMR của PN3, các tín hiệu các tín hiệu chồng chập tại vùng trường cao điển hình của một hợp chất có khung damaran, trong đó có 8 tín hiệu singlet của các nhóm methyl bậc ba tại δ 1,05 (H-18), 0,88 (H-19),1,37 (H-21), 1,71 (H-26), 1,65 (H-27),1,09 (H-28), 0,95 (H-29) và 0,95 (H-30), một nối đôi thế

ba lần với sự có mặt của tín hiệu proton methin tại δ5,13 (1H, t, J= 6,5 Hz, H- 24).Hai tín hiệu của hai nhóm methyl dịch chuyển mạnh về phía trường thấp hơn tạiδ 1,71 (H-26) và 1,65 (H-27) gợi ý rằng chúng đều được gắn vào nối đôi. Ngoài ra, trên phổ này còn xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng trong vùng từ δ 3,09- 4,70 ppm đặc trưng cho sự có mặt của các proton oxymethin và oxymethylen của các phân tử đường cũng như proton oxymethin khác. Ba phân tử đường glucose được nhận biết bởi các tín hiệu proton anome tại δ4,69 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 4,46 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1′′) và 4,62 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1′′′).

Trên phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 48 nguyên tử cacbon, trong đó 18 tín hiệu được xác định thuộc vào 3 phân tử đường glucose [3-Glc: δ 104,5 (C-1′), 81,2 (C-2′), 78, 3 (C-3′), 71 , 6 (C-4′), 78,3 (C-5′), 62,8 (C-6′); 2'- Glc: δ 105,4 (C-

1′′),76,3 (C-2′′), 78,5 (C-3′′), 71,9 (C-4′′), 77,7 (C-5′′), 63,1 (C-6′′); 20- Glc: 98,3

(C-1′′′), 75,4 (C-2′′′), 78,3 (C-3′′′), 71,9 (C-4′′′), 77,9 (C-5′′′), 62,6 (C-6′′′),và 30 tín

hiệu còn lại thuộc vào phần aglycon với nối đôi duy nhất tại δ 125,9 (C-24) và 132,3 (C-25). Phân tích phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thấy sự có mặt của tín hiệu cacbon bậc ba nối với nguyên tử oxy tại δ 84,9 (C-20) cacbon CH tại δ 53,1 (C-17) điển hình cho hợp chất có khung dammaran mà phân tử đường glucose nối vào vị trí C-20 [126], [127]. Hai tín hiệu khác của các cacbon oxymethin tại δ 91,3 (C-3) và 71,2 (C-12) cũng được xác định.

Điểm khác biệt trên 13C-NMR của hợp chất PN3 so với PN1 là sự xuất hiện của một nhóm methylen δ 19,3 (C-6) thay vì nhóm methin ở δ 80,9 (C-6) trong PN1, và độ chuyển dịch về trường cao hơn của cacbon methin tại C-3 (δ 91,3) trong PN3 so với PN1 (δ 79,9)chứng tỏ vị trí liên kết của đường với khung dammaran chuyển từ vị trí C-6 (ở PN1) sang vị trí C-3 trong PN3. Nhận định này được làm sáng tỏ hơn khi phân tích các tương quan HMBC của hợp chất này.

Phổ ESI-MS của hợp chất PN3 cho pic ion m/z 983.4 [M+2H2O+H]+ tương ứng với khối lượng M= 946 đvC và công thức phân tử C48H82O18.

Bằng cách khảo sát, phân tích dữ kiện phổ 1D-NMR, các tương tác C-H trên HMBC, HSQC cùng với việc tham khảo tài liệu [131] đối với PN3, cho phép kết luận hợp chất PN3 là 3-O-[β-D-glucopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl]-20-O- β-D-glucopyranosyl-3β, 12β,20β-trihydroxydammar-24-ene hay Ginsenosid Rd.

* Hợp chất PN4

Phổ NMR của hợp chất PN4 cho các pic cộng hưởng có độ chuyển dịch giống như của hợp chất PN3 (xem bảng 3.4), ngoài ba đường glucose với vị trí liên kết tương tự hợp chất PN3, ở hợp chất PN4 còn có thêm một vòng đường glucose nữa liên kết với C-6′′′ của PN3 thông qua liên kết O-glucoside. Điều này được thể hiện rõ nét qua tương quan HMBC của hợp chất PN4. Thêm vào đó, phổ khối lượng của PN4 cho pic ion: m/z 1132.2 [M+Na]+, (M= 1108 đvC; C54H92O23), như vậy PN4 có khối lượng lớn hơn PN3 là 162 đvC đúng bằng khối lượng của một phân tử đường bị đề hydrat hóa khi tạo liên lết O-glucoside.

Từ các dữ kiện phổ được dẫn ra tại bảng 3.4 kết hợp tài liệu tham khảo [131] có thể kết luận hợp chất PN4 là 3-O-[β-D-glucopyranosyl (1→2)-β-D- glucopyranosyl]-20-O-[β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl]-3β, 1 2β, 2 0β- trihydroxydammar-24-ene hay Ginsenosid Rb1

* Hợp chất PN5

Hợp chất PN5 có phổ của phần aglycon tương tự như phổ của hợp chất PN3 và PN4, Tuy nhiên ở hợp chất PN5, chỉ xuất hiện tín hiệu của 2 phân tử đường glucose liên kết với phần aglycon ở vị trí carbon số 3. Độ chuyển dịch của cacbon ở vị trí số 20 về trường cao hơn (δ 74,4) ở PN5 so với PN3 và PN4 (δ 84,9) cho dự đoán về sự biến mất của đường tại vị trí này. Điều này có thể thấy rõ hơn qua kết quả phổ khối lượng với píc ion m/z (positive) ở m/z: 789.6 [M+5H]5+ , tương ứng với khối lượng phân tử M= 784 đvC, phù hợp với công thức phân tử C42H72O13. Kết hợp với việc phân tích các dữ kiện phổ 1H, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và tài liệu tham khảo [132] cho phép kết luận về cấu trúc của hợp chất PN5 là3-O-[β-D- glucopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl]-3β, 1 2β, 2 0β- trihydroxydammar-24- ene hay Ginsenosid Rg3.

HO CH2 OHO

O 1"'

CH322 24

CH3

HO CH322 24 26

11 17

CH3 27

27CH3

18 19 13

18 12 17

1 CH3 9CH3 14

19 13

1 CH3 9CH3 14

6' CH2OH

10 5 8

CH3

10 8

CH 15

O O 3 4 7 30

CH2OH 3 5

O O

30 3

1'H3C CH3

OH 1'H3C CH3

OH 2'

28 29

OH 2'

28 29

CH2OHO

OHO

PN3-Rd

HOH2C O O

OH 1"

PN5-Rg3

1"" OHO

1"' 20

CH3

19 13

CH3 9 CH3 14

CH3

CH2OH21

CH2OH

OHO

O CH2

CH322 24 26

O O CH2 CH

CH3

OH O O3

CH3

6' CH OH

CH2OH

CH3

OH OH

CH3

OHO

1' H3C CH3

OHOO

H3C CH3

OH 2'

HOH2C O OHO

28 29

PN4-Rb1

HOH2C O OH

HMBC collerations of PN4

Hình 3.4. Các hợp chất phân lập từ thân rễ Tam thất (P. notoginseng) (PN3, PN4, PN5) và phổ HMBC chọn lọc của hợp chất PN4

3.1.2. Kết quả nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất khi hấp ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3.1.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký

Tiến hành sắc ký như mô tả ở mục 2.2.1.2, thu được sắc ký đồ như hình 3.5.

Hình 3.5. Sắc ký đồ một số mẫu dịch chiết Tam thất

(1: Rg1, 2: Re, 3: Rd, 4: Rb1, 5: Rg3, 6: Rh1)

Hình ảnh trên sắc ký đồ cho thấy với điều kiện sắc ký đã chọn, các chất cần phân tích cho các pic tách nhau rõ ràng, có thể dùng để định lượng các mẫu nghiên cứu.

3.1.2.2. Xây dựng đường chuẩn

Tiến hành như đã mô tả ở mục 2.2.1.2. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.6.

Bảng 3.5. Kết quả xây dựng đường chuẩn

Nồng độ (µg/ml)

Diện tích pic
Rg1	Re	Rb1	Rh1	Rd	Rg3
50	237420	203246	248534	367547	213028	314887
100	482741	411054	577000	881443	376099	615333
250	1194066	1022877	946749	1783151	929541	1491191
750	3562974	3055435	2633396	5134706	2639867	4283532
1000	4782154	4099647	3611931	6889350	3544766	5693495
1250	6285688	4690307	4245554	8146239	4381079	6951359
1500	7972059	5341087	5073620	9795781	5276054	8323176
Phương trình đường chuẩn	y=5181.3 x-124483	y=3661.5 x+126065	y=3304.7 x+163421	y=6470.5 x+184682	y=3486.9 +39266	y=5524.3 x+86267
R2	0.9955	0.9917	0.9982	0.9987	0.9999	0.9997