Thẩm Định Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Monotropein

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose

3.1.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein

3.1.1.1. Độ thích hợp của hệ thống

- Lượng cân chất chuẩn monotropein: 10,42 mg.

Kết quả độ thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày tại Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Độ thích hợp hệ thống sắc ký phương pháp định lượng monotropein

Stt

Thời gian lưu (phút)	Diện tích (mAU.s)	Số đĩa lý thuyết	Hệ số đối xứng pic
1	7,229	802390	9808	1,1
2	7,269	803454	9670	1,1
3	7,265	802559	9913	1,1
4	7,263	804932	9815	1,1
5	7,259	803247	9912	1,1
6	7,245	802691	9677	1,1
TB	7,255	803212	9799	1,1
% RSD	0,21	0,12
Yêu cầu	≤ 2,0 %	≤ 2,0 %	≥ 4000	0,8 – 1,5

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

Kết quả cho thấy hệ thống HPLC sử dụng có độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn

tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic lần lượt là 0,2 % và 0,1 % (< 1

%), số đĩa lý thuyết của từng pic đều > 4.000, hình dáng các pic cân đối (hệ số đối xứng của từng pic đều gần bằng 1). Như vậy, hệ thống HPLC phù hợp để định tính, định lượng monotropein theo phương pháp khảo sát.

3.1.1.2. Độ đặc hiệu

- Lượng cân chất chuẩn monotropein: 10,42 mg.

- Lượng cân nguuyên liệu monotropein: 10,35 mg.

- Lượng cân bột dược liệu BK5 (hàm ẩm 10,49 %): 0,6091 g. Kết quả xác định độ đặc hiệu được trình bày tại Hình 3.1.

(a) Dung dịch chuẩn monotropein (b) Dung môi

Ch1-237nm,4nm (1.00)

Monotropein/7.137/349792

mAU

/8.994/161416

/8.625/2109

(b) Dung dịch thử (Định lượng monotropein trong nguyên liệu)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

(b) Dung dịch thử (Định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba

kích)

Hình 3.1. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phương pháp định tính, định lượng monotropein

Kết quả trên sắc ký đồ tại Hình 3.1 cho thấy: Dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic monotropein trong dung dịch chuẩn (7,2 phút) và dung môi không cho pic tại thời gian lưu này. Kết quả chồng phổ UV của 2 pic tại thời gian lưu 7,2 phút là 0,998, độ tinh khiết của 2 pic này đều bằng 1. Như vậy, phương pháp HPLC-DAD với điều kiện đã chọn đặc hiệu với monotropein.

3.1.1.3. Độ tuyến tính

- Lượng cân chất chuẩn monotropein trong dung dịch chuẩn gốc: 10,42 mg.

Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ monotropein được trình bày ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng monotropein

Dung dịch chuẩn

20 %	60 %	100%	140 %	200 %
Nồng độ (µg/ml)	10,32	30,95	51,58	72,21	103,16
Diện tích pic (mAU.s)	168888	474933	803212	1135269	1611123
Hệ số góc (slope)	15618
Hệ số chắn (intercept)	871,9
Hệ số tương quan (correl)	0,9999

Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic monotropein trong khoảng nồng độ từ 10,3 µg/ml – 107,4 µg/ml với hệ số tương quan gần bằng 1 (r = 0,9999).

3.1.1.4. Độ chính xác

a. Định lượng monotropein trong nguyên liệu

- Ngày định lượng 1: Thiết bị phân tích: Shimadzu. Lượng cân chuẩn: 10,42 mg. Diện tích pic: 803212 mAU.s (Kết quả của độ lặp lại).

- Ngày định lượng 2: Thiết bị phân tích: Shimadzu. Lượng cân chuẩn: 10,48 mg. Diện tích pic: 803216 mAU.s

Kết quả khảo sát độ chính xác phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu được trình bày tại Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu

Ngày 1

Ngày 2
Stt	Lượng cân thử (mg)	Diện tích pic (mAU.s)	Hàm lượng (%) nguyên trạng	Stt	Lượng cân thử (mg)	Diện tích pic (mAU.s)	Hàm lượng (%) nguyên trạng
1	10,48	798170	97,82	1	10,51	798973	98,20
2	10,52	793542	96,88	2	10,65	793164	96,20
3	10,31	794374	98,96	3	10,41	793767	98,49
4	10,28	796243	99,48	4	10,38	794913	98,92
5	10,56	803701	97,75	5	10,56	805388	98,52
6	10,63	806637	97,46	6	10,65	807426	97,93
Trung bình (n=6): 98,06 % RSD = 0,99 %				Trung bình (n=6): 98,04 % RSD = 0,98 %
Kết quả định lượng trung bình (n=12): 98,05 % với RSD=0,94 %

b. Định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích

- Mẫu thử: BK5 (độ ẩm: 10,49 %).

- Ngày định lượng 1: Thiết bị phân tích: Shimadzu. Lượng cân chất chuẩn monotropein: 10,85 mg. Diện tích pic: 803212 mAU.s (Kết quả của độ lặp lại).

- Ngày định lượng 2: Thiết bị phân tích: Hitachi. Lượng cân chất chuẩn monotropein: 10,42 mg. Diện tích pic: 3097657 mAU.s.

Kết quả khảo sát độ chính xác phương pháp định lượng monotropein trong dược liệu BK5 được trình bày tại Bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein

trong dược liệu BK5

Stt

Ngày 1			Ngày 2
Lượng cân thử (g)	Diện tích pic (mAU.s)	Hàm lượng monotropein (%) dược liệu khô kiệt	Lượng cân thử (g)	Diện tích pic (mAU.s)	Hàm lượng monotropein (%) dược liệu khô kiệt
1	0,6091	349792	2,1	0,6001	1352506	2,1
2	0,6062	351099	2,2	0,6017	1360992	2,1
3	0,6089	352394	2,2	0,6008	1360629	2,1
4	0,6071	348900	2,1	0,6006	1351038	2,1
5	0,6098	352052	2,2	0,6010	1358390	2,1
6	0,6081	351728	2,2	0,6012	1357386	2,1
Trung bình (n = 6): 2,2 % RSD = 0,4 %				Trung bình (n=6): 2,1 % RSD = 0,3 %
Kết quả định lượng trung bình (n=12): 2,1 %; RSD = 1,3 %

Kết quả cho thấy phương pháp có độ chính xác cao, thể hiện độ lặp lại trong ngày với RSD ≤ 1,0 % và khác ngày RSD ≤ 1,3 %.

3.1.1.5. Độ đúng

a. Định lượng monotropein trong nguyên liệu

- Lượng cân chất chuẩn monotropein: 10,42 mg.

Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu được trình bày tại Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu

Stt

Dung dịch	Lượng cân chất chuẩn monotropein (mg)	Diện tích pic (mAU.s)	Lượng monotropein tìm lại (mg)	Tỷ lệ thu hồi (%)
1	80%	8,51	644738	8,28	98,3
2	80%	8,42	645847	8,30	99,5
3	80%	8,44	646170	8,30	99,3
4	100%	10,45	805338	10,34	100,0
5	100%	10,46	794327	10,20	98,5
6	100%	10,42	804653	10,33	100,2
7	120%	12,45	974130	12,51	101,5
8	120%	12,46	975220	12,53	101,5
9	120%	12,48	974700	12,51	101,3
Trung bình					100,0
RSD %					1,2

b. Định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích

- Lượng cân chất chuẩn monotropein trong dung dịch chuẩn: 10,85 mg.

- Lượng cân chất chuẩn monotropein trong dung dịch chuẩn gốc: 58,68 mg.

- Mẫu thử Ba kích BK5: Hàm lượng monotropein là 2,1 % (Bảng 3.4), độ ẩm: 10,49 %.

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích được trình bày ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng monotropein trong

dược liệu BK5

Stt

Lượng cân thử (g)	Lượng chất chuẩn monotropein thêm vào (mg)	Diện tích pic (mAU.s)	Lượng chất chuẩn monotropein tìm lại (mg)	Tỷ lệ thu hồi (%)
1	0,3095	3,49	281049	3,50	100,2
2	0,3068	3,49	281324	3,56	102,0
3	0,3072	3,49	280014	3,51	100,6
4	0,2957	5,81	343411	5,84	100,5
5	0,2983	5,81	343387	5,79	99,7
6	0,2954	5,81	344087	5,87	101,0
7	0,3076	8,13	415679	8,02	98,7
8	0,3098	8,13	415778	7,98	98,2
9	0,3087	8,13	415453	7,99	98,3
Trung bình					99,9
RSD (%)					1,3

Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng tốt (phần trăm tìm lại trong nguyên liệu và trong dược liệu lần lượt đạt từ 98,3 % - 101,5 % và 98,2 % - 102,0 %) với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2,0 % (1,2 % và 1,3 %).

3.1.1.6. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

- Dung dịch có nồng độ monotropein 0,26 µg/ml xuất hiện pic và có tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu (S/N) là 2,7 :1 (Hình 3.2).

- Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch dung dịch chuẩn có nồng độ monotropein 0,86 µg/ml (gấp 3,3 lần nồng độ LOD) vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ.

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic monotropein tại nồng độ 0,86 µg/ml lần lượt là 1,5 % và 1,8 % (< 2,0%). Như vậy, giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,26 µg/ml; giới hạn định lượng của phương pháp là 0,86

µg/ml.

(a). LOD

(b). LOQ

Hình 3.2. Sắc ký đồ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của monotropein

3.1.2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose

3.1.2.1. Độ thích hợp của hệ thống

- Lượng cân chất chuẩn nystose: 11,35 mg

Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày tại Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Độ thích hợp hệ thống phương pháp định lượng nystose

Stt

Thời gian lưu (phút)	Diện tích pic (mV.s)	Ln(diện tích pic)	Số đĩa lý thuyết
1	5,732	390054	12,87	19.188
2	5,720	374751	12,83
3	5,727	406781	12,92
4	5,700	415190	12,94
5	5,688	426549	12,96
6	5,688	421085	12,95
TB	5,709	405735	12,91
% RSD	0,34		0,38
Yêu cầu	≤ 2,0 %		≤ 2,0 %	≥ 2.000

Kết quả cho thấy hệ thống HPLC-ELSD sử dụng có độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và Ln(diện tích pic) lần lượt là 0,3 % và 0,4

% (< 1 %), số đĩa lý thuyết > 2.000, hình dáng các pic cân đối (Hệ số đối xứng của từng pic đều gần bằng 1). Như vậy, hệ thống sắc ký phù hợp để định tính, định lượng nystose theo phương pháp khảo sát.

3.1.2.2. Độ đặc hiệu

a. Phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu

- Lượng cân chất chuẩn nystose: 11,35 mg.

Signal Thiet lap

Area

Retention Tim

chuan Nystose

Name

Nystose

5.783

3869

Signal Thiet lap

Area

Retention Tim

chuan Nystose

Name

Nysto

396805

5.7

- Lượng cân mẫu thử (định lượng trong nguyên liệu): 10,08 mg. Kết quả độ đặc hiệu của phương pháp được trình bày tại Hình 3.3.

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Minutes

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Minutes

100

(a) Dung dịch chuẩn (b) Dung dịch thử

an Nystose

10 10

Signal

Thiet lap chu

Area

Retenti on T i m e

9 Nam e 9

8 8

7 7

6 6

(Nystose)

5 5

4 4

3 3

2 2

1 1

0 0

-1 -1

-2 -2

-3 -3

-4 -4

-5 -5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Minutes

Hình 3.3. Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu

b. Phương pháp định lượng nystose trong dược liệu

- Lượng cân chất chuẩn nystose: 11,21 mg.

- Lượng cân mẫu thử BK5 (định lượng trong dược liệu): 0,5091 g. Kết quả độ đặc hiệu của phương pháp được trình bày tại Hình 3.3.

(a) Dung dịch chuẩn (b) Dung dịch thử

Area

10 10

Signal

Thiet lap chuan Nystose

Retention Time

9 Name 9

8 8

7 7

6 6

(Nystose)

5 5

4 4

3 3

2 2

1 1

0 0

-1 -1

-2 -2

-3 -3

-4 -4

-5 -5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Minutes

Hình 3.4. Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích Kết quả cho thấy: Sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic nystose thu được trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu trắng không có pic tại thời gian lưu của pic nystose trong dung dịch chuẩn. Như vậy, phương pháp HPLC – Detector ELSD với điều kiện đã

chọn đặc hiệu với nystose.

3.1.2.3. Độ tuyến tính

- Lượng cân chất chuẩn nystose: 11,35 mg.

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp được trình bày trong Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng nystose

Stt

Dung dịch chuẩn	Nồng độ (µg/ml)	Diện tích pic (mV.s)	Ln(nồng độ)	Ln(diện tích pic)
1	25%	113,05	69412	4,73	11,15
2	50%	226,09	168711	5,42	12,04
3	100%	452,18	467757	6,11	13,06
4	150%	678,28	787113	6,52	13,58
5	200%	904,37	1307759	6,81	14,08
Hệ số góc (slope):			1,40
Hệ số chắn (intercept):			4,48
Hệ số tương quan (correl):			0,9992