- Dung dịch đối chiếu: Lấy chính xác 1 ml dung dịch thử và pha loãng thành 100 ml bằng MeOH.
Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 l mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi được khoảng ¾ bản mỏng, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí và phun thuốc thử hiện vết, sấy bản mỏng ở 110 ºC trong 3 phút.
Đánh giá: Quan sát bản mỏng ở ánh sáng thường, so sánh màu sắc, kích thước của vết phụ trên sắc ký đồ của dung dịch thử với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
2.3.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein và nystose
Căn cứ kết quả thực tế kiểm tra chất lượng nguyên liệu, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng monotropein và nystose, bao gồm các tiêu chí [24], [51], [80]:
- Mục đích sử dụng.
- Yêu cầu kỹ thuật: Định tính, mất khối lượng do làm khô, nhiệt độ nóng chảy,
định lượng, tạp chất liên quan.
2.3.3.3. Đóng lọ chuẩn
- Chuẩn bị lọ đóng chuẩn: Lọ thủy tinh màu nâu, thể tích 2 ml được rửa, sấy
khô.
- Khối lượng chuẩn trong 1 lọ: khoảng 20 mg
- Đóng ống chuẩn trong buồng sạch Glove Box Terra Universal được nạp khí
nitơ trơ, kiểm soát điều kiện nhiệt độ (khoảng 25 oC), độ ẩm (tương đương hoặc thấp
hơn độ ẩm của nguyên liệu) [24].
2.3.3.4. Đánh giá đồng nhất lô
- Lấy ngẫu nhiên 10 lọ chất chuẩn đã đóng gói, tiến hành xác định hàm lượng (tính theo nguyên trạng) của hoạt chất trong từng lọ, sử dụng phương pháp phân tích tại Mục 2.3.1.1 - a (đối với thiết lập chất chuẩn monotropein) và Mục 2.3.1.1 – b (đối với thiết lập chất chuẩn nystose) [24].
- Lô sản xuất được coi là đồng nhất khi giá trị RSD (%) của kết quả hàm lượng giữa các lọ được kiểm tra ≤ 1,0 % Điều kiện đóng gói ổn định, mẫu nguyên liệu đóng trong các lọ là đồng nhất [24].
2.3.3.5. Đánh giá liên phòng thí nghiệm và công bố hàm lượng
- Áp dụng phương pháp định lượng tại Mục 2.3.1.1 - a (đối với thiết lập chất chuẩn monotropein) và Mục 2.3.1.1 – b (đối với thiết lập chất chuẩn nystose).
- Đánh giá trên 2 phòng thí nghiệm, mỗi phòng thí nghiệm nhận được chất chuẩn gốc và 06 lọ bán thành phẩm chất chuẩn.
- Kết quả phòng thử nghiệm 1: Lấy từ kết quả đánh giá đồng nhất lô.
- Kết quả phòng thử nghiệm 2: Lấy từ kết quả 6 thử nghiệm độc lập.
- Tập hợp kết quả của 2 KTN, tính kết quả công bố trến chứng chỉ [24].
2.3.3.6. Xử lý số liệu, đánh giá kết quả
- Xử lý kết quả giữa các phòng thử nghiệm, kiểm nghiệm viên: Áp dụng phân tích Student T-test khi số phòng thử nghiệm (kiểm nghiệm viên) tham gia bằng 2 (với α = 0,05) [24]:
+ Nếu Ttn< Ttc: Kết quả phân tích của 2 phòng thử nghiệm (kiểm nghiệm viên)
khác nhau không có ý nghĩa thống kê;
+ Nếu Ttn> Ttc: Kết quả phân tích của 2 phòng thử nghiệm (kiểm nghiệm viên) khác nhau có ý nghĩa thống kê → Xem xét kết quả, có thể đề nghị phòng thử nghiệm (kiểm nghiệm viên) có giá trị độ lệch chuẩn (S) lớn tiến hành lại thực nghiệm.
- Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối theo công thức sau [24]:
+ Tính giá trị trung bình:
𝑛
𝑋̅ = 1 ∑ 𝑥
+ Tính độ lệch chuẩn:
𝑛 𝑖
𝑖=1
∑𝑛(𝑥𝑖−𝑋̅)2
S=√
𝑖=1
𝑛
+ Tính độ lệch chuẩn tương đối:
RSD (%) = S × 100
X̅
- Tính độ không đảm bảo đo mở rộng của kết quả công bố trên chứng chỉ: Kết quả công bố trên chứng chỉ phân tích là giá trị trung bình từ tập hợp các kết quả phân tích với 16 phép thử (n > 10), độ không đảm bảo đo của giá trị này được tính theo loại A, với hệ số phủ k = 2 ở mức tin cậy 95 % [24].
n
U S x2
2.3.3.7. Nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn monotropein và nystose
a. Điều kiện bảo quản
- Chất chuẩn được bảo quản tại điều kiện 2 oC – 8 oC. b. Phương pháp nghiên cứu
* Phép thử định lượng [24]:
- Tiến hành thử nghiệm trên 06 thử của ít nhất 3 lọ khác nhau.
- Phương pháp thử theo Mục 2.3.1.1 - a (đối với định lượng monotropein) và
Mục 2.3.1.1 – b (đối với định lượng nystose).
- Yêu cầu: Hàm lượng chất chuẩn không sai khác quá 1,0 % so với hàm lượng chuẩn công bố; Giá trị (%) RSD 1,0 %.
* Phép thử xác định tạp chất [24]:
- Tiến hành kiểm tra trên 3 lọ (ống) mẫu thử riêng biệt
- Phương pháp thử theo Tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn.
- Yêu cầu: Hàm lượng tạp chất phải đạt theo yêu cầu của Tiêu chuẩn chất lượng.
2.3.3.8. Định tính, định lượng monotropein, nystose trong dược liệu rễ Ba kích.
a. Chuẩn bị mẫu thử
Dược liệu rễ Ba kích sau khi thu hái được rửa sạch, bỏ lõi, thái nhỏ, sau đó
nghiền thành bột mịn và cho rây qua rây 250 µm. b. Định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích
Sử dụng chất chuẩn monotropein mới thiết lập để định lượng monotropein trong
dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp HPLC – DAD tại Mục 2.3.1 – a. c. Định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích
Sử dụng chất chuẩn nystose mới thiết lập để định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp HPLC – ELSD tại Mục 2.3.1 – b.
2.3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN
2.3.4.1. Chiết tách ADN từ rễ Ba kích
* Bước 1: Lấy mẫu để tách DNA
Các mẫu rễ dược liệu tươi tại Bảng 2.1 được rửa sạch bằng nước, cắt nhỏ.
* Bước 2: Phá vỡ thành tế bào và nhân
- Mẫu dược liệu để trong tủ lạnh âm sâu tại nhiệt độ khoảng -80 oC trong 12 giờ.
Sau đó nghiền mẫu bằng cối sứ.
* Bước 3: Hòa tan DNA và loại bỏ tạp chất [44].
- Thêm 400 µl đệm AP1 và thêm 4 µl RNase. Lắc rung và ủ 10-15 phút ở 65
oC. Lắc khoảng 2-3 lần trong thời gian ủ.
- Thêm 130 µl đệm P3. Trộn đều và ủ 5 phút trong nước đá.
- Ly tâm 5 phút ở 14.000 vòng/phút.
- Thu dịch ly tâm cho vào cột ly tâm Qiashredder. Ly tâm 2 phút ở 14.000 vòng/phút.
- Thu dịch cho qua ống eppendorf mới. Thêm 1,5 thể tích đệm AW1, trộn đều.
- Lấy 650 µl hỗn dịch trên cho vào cột ly tâm Dneasy Mini, ly tâm 1 phút ở
8.000 vòng/phút, loại bỏ nước lọc. Tiếp tục với lượng hỗn dịch còn lại.
* Bước 4: Kết tủa DNA
- Chuyển cột ly tâm Dneasy Mini sang ống ly tâm (spin tube) mới. Thêm 500
µl đệm AW2, ly tâm 1 phút ở 8.000 vòng/phút, loại nước lọc.
- Thêm tiếp 500 µl đệm AW2, ly tâm 2 phút ở 14.000 vòng/phút.
- Chuyển cột ly tâm sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
- Thêm 100 µl đệm AE để hòa tan DNA. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (15 – 25
oC). Ly tâm 1 phút ở 8.000 vòng/phút.
* Bước 5: Kiểm tra ADN tách chiết
- Điện di trên gel
+ Gel agarose: Cân 0,3 g agarose vào 30 ml TBE 1X. Đun chảy. Để nguội 45
oC và đổ vào khuôn đã cài lược sẵn. Để gel đông ở nhiệt độ phòng.
+ Đệm điện di: Đệm TBE 10X được pha thành 1X.
+ Mẫu điện di: 3 µl Mẫu DNA tách chiết + 1 µl Loading dye + 2 µl Run safe.
+ Tiến hành: Cho đệm điện di vào buồng điện di sao cho ngập bản gel, hút 5 µl mẫu điện di vào giếng đã tạo sẵn. Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 50 mV trong 25 phút. Sau khi điện di, soi Bản gel trên máy soi gel ở bước sóng 302 nm.
- Đo mật độ quang
+ Tiến hành đo mật độ quang (A) dung dịch ADN tại bước sóng 260 nm (OD260
= 1 tương ứng với nồng độ ADN là 50 µg/ml) và bước sóng 280 nm [44].
+ Hàm lượng ADN được xác định bằng công thức: CDNA = OD260 x 50 x X (µg/ml) [44]
Trong đó: OD260: Mật độ quang tại bước sóng 260 nm.
X: là hệ số pha loãng dung dịch DNA.
- Độ tinh sạch của ADN được xác định bằng tỷ lệ OD260/OD230 và OD260/OD280. ADN được coi là tinh sạch khi các tỷ lệ trên lớn hơn 1,8 [46].
2.3.4.2. Nhân bản đoạn gen
* Khuếch đại gen
Khuếch đại các trình tự ITS, rcbL, trnH-pbsA, matK sử dụng các thành phần phản ứng có nồng độ như trong Bảng 2.5.
Bảng 2.5. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng
Thành phần phản ứng | Thể tích | |
1 | 10mmM dNTPs | 0,4 µl |
2 | Phire Hot Start II DNA polymerase | 0,4 µl |
3 | Buffer Phire 5x | 4 µl |
4 | Mồi xuôi | 0,5 µl |
5 | Mồi ngược | 0,5 µl |
6 | Dịch chiết DNA | 1-3 µl |
7 | Nước | Vừa đủ 23 µl |
Có thể bạn quan tâm!
-
![Sơ Đồ Và Các Chu Kỳ Của Phản Ứng Chuỗi Polymerase [15]](https://tailieuthamkhao.com/uploads/2024/04/20/nghien-cuu-nang-cap-tieu-chuan-duoc-lieu-re-ba-kich-radix-morindae-officinalis-5-3-120x90.jpg)
![Sơ Đồ Và Các Chu Kỳ Của Phản Ứng Chuỗi Polymerase [15]](data:image/svg+xml,%3Csvg%20xmlns=%22http://www.w3.org/2000/svg%22%20viewBox=%220%200%2075%2075%22%3E%3C/svg%3E)
Sơ Đồ Và Các Chu Kỳ Của Phản Ứng Chuỗi Polymerase [15] -
Thẩm Định Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Monotropein Và Nystose -
![Nội Dung Thẩm Định Phương Pháp Định Lượng Nystose [52]](https://tailieuthamkhao.com/uploads/2024/04/20/nghien-cuu-nang-cap-tieu-chuan-duoc-lieu-re-ba-kich-radix-morindae-officinalis-7-120x90.jpg)
Nội Dung Thẩm Định Phương Pháp Định Lượng Nystose [52] -
Thẩm Định Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Monotropein -
Kết Quả Độ Chính Xác Trung Gian Của Phương Pháp Định Lượng Nystose Trong Nguyên Liệu -
Sơ Đồ Phân Lập, Tinh Chế Nystose Từ Cao Chiết Nước
Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.
Các mồi chung được sử dụng để khuếch đại các trình tự ITS, rcbL, trnH-pbsA, matK như trong Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Các mồi chung cho các trình tự ITS và các gen trên chloroplast
Trình tự DNA | Tác giả | Vị trí trên gen | |
ITS1 - ITS4 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | White et al. (1990) [84] | ITS1-5,8S- ITS2 |
TCCTCCGCTTATTGATATGC | |||
ITS U4- ITS P5 | RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA | Tao Cheng et al. (2015) [36] | ITS1-5,8S- ITS2 |
CCTTATCAYTTAGAGGAAGGAG | |||
1326R- 390F | TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T | Cu´enoud et al. 2002 [39] | matK |
CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C | |||
rcbLaF- rcbLaR | ATGTCACCACAAACAGAGACTAA AGC | Levin et al., modifi ed from Soltis et al. [56] | rcbL |
GTAAAATCAAGTCCACCRCG | Kress and Erickson, modified from Fofana et al. [54] | ||
psbA- trnH | CGAAGCTCCATCTACAAATGG | Hamilton [48] | trnH-psbA |
Chương trình chạy PCR: Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS1-ITS4 , ITS U4- ITS P5, matK 1326R-390F, rcbLaF-rcbLaR và trnH-pbsA được trình bày lần lượt tại Bảng 2.7, Bảng 2.8, Bảng 2.9, Bảng 2.10 và Bảng 2.11.
Bảng 2.7. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS1-ITS4 [84]
Nhiệt độ (oC) | Thời gian | Số chu kỳ | |
Khởi đầu | 98 | 5 phút | 1 |
Biến tính | 98 | 30 giây | |
Bắt cặp | 55 | 40 giây | 35 |
Kéo dài | 72 | 1 phút | |
Kết thúc | 72 | 10 phút | 1 |
Bảng 2.8. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS U4-ITS P5 [36]
Nhiệt độ (oC) | Thời gian | Số chu kỳ | |
Khởi đầu | 98 | 5 phút | 1 |
Biến tính | 98 | 30 giây | |
Bắt cặp | 55 | 40 giây | 35 |
Kéo dài | 72 | 1 phút | |
Kết thúc | 72 | 10 phút | 1 |
Bảng 2.9. Chương trình PCR cho đoạn mồi của matK 1326R-390F [39]
Nhiệt độ (oC) | Thời gian | Số chu kỳ | |
Khởi đầu | 98 | 5 phút | 1 |
Biến tính | 98 | 30 giây | |
Bắt cặp | 50 | 40 giây | 35 |
Kéo dài | 72 | 40 giây | |
Kết thúc | 72 | 5 phút | 1 |
Bảng 2.10. Chương trình PCR cho đoạn mồi của rcbLaF-rcbLaR [54], [56]
Nhiệt độ (oC) | Thời gian | Số chu kỳ | |
Khởi đầu | 98 | 5 phút | 1 |
Biến tính | 98 | 15 giây | |
Bắt cặp | 55 | 30 giây | 35 |
Kéo dài | 72 | 40 giây | |
Kết thúc | 72 | 10 phút | 1 |
Bảng 2.11. Chương trình PCR cho đoạn mồi của trnH-pbsA [48]
Nhiệt độ (oC) | Thời gian | Số chu kỳ | |
Khởi đầu | 98 | 5 phút | 1 |
Biến tính | 98 | 15 giây | |
Bắt cặp | 64 | 30 giây | 35 |
Kéo dài | 72 | 40 giây | |
Kết thúc | 72 | 10 phút | 1 |
Mỗi phản ứng PCR được lặp lại ít nhất 3 lần.
* Kiểm tra kết quả khuếch đại gen bằng phương pháp điện di
- Gel agarose: Cân 0,3 g agarose vào 30 ml TBE 1X. Đun chảy. Để nguội 45 oC
và đổ vào khuôn đã cài lược sẵn. Để gel đông ở nhiệt độ phòng.
- Đệm điện di: Cho Đệm TBE 10X được pha thành 1X.
- Mẫu điện di: 3 µl sản phẩm PCR + 1 µl Loading dye + 2 µl Run safe.
- Tiến hành: Cho đệm điện di vào buồng điện di sao cho ngập bản gel, hút 5 µl mẫu điện di vào giếng đã tạo sẵn. Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 50 mV trong 25 phút. Sau khi điện di, soi Bản gel trên máy soi gel ở bước sóng 302 nm.
2.3.4.3. Giải trình tự đoạn gen và định danh dược liệu
Pha loãng sản phẩm PCR bằng cách thêm 15 µl đệm điện di vào mỗi giếng. Ly tâm. Dùng các đoạn mồi tương tự như trong phản ứng PCR. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng trong quá trình giải trình tự gen được trình bày tại Bảng 2.12.
Bảng 2.12. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng giải trình tự đoạn gen
Thành phần phản ứng | Thể tích (µl) | |
1 | 5X Sequencing Buffer | 1,875 |
2 | 10 μM primer | 1 |
3 | BigDye | 0,250 |
4 | Nước | 5,875 |
5 | Diluted DNA | 2 |
Chương trình giải trình tự: 94 °C trong 10 giây; 35 chu kỳ bao gồm 94 °C trong 20 giây, 50 °C trong 20 giây, 60 °C trong 4 phút.
* Phân tích dữ liệu:
- Sau khi giải trình tự, đọc và kết nối các trình tự bằng phần mềm DNASTAR
[43].
- So sánh các trình tự với ngân hàng gen trên NCBI bằng công cụ BLAST.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) là công cụ tìm các vị trí tương đồng cục bộ giữa các trình tự sinh học DNA, được phát triển bởi NCBI. BLAST tìm kiếm giữa chuỗi truy vấn với chuỗi có trong CSDL bằng phương pháp heurictic, giải thuật Smith-Waterman [28].
- Xếp hàng và so sánh trình tự, so sánh khoảng cách di truyền bằng công cụ MEGA 6.0 [78].
2.3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính, định lượng
- Chỉ tiêu định tính:
+ Định tính monotropein bằng phương pháp HPLC - DAD.
+ Định tính nystose bằng phương pháp TLC; HPLC - ELSD.
- Chỉ tiêu định lượng:
+ Định lượng monotropein bằng phương pháp HPLC - DAD.
+ Định lượng nystose bằng phương pháp HPLC - ELSD.