Xây Dựng Tiêu Chuẩn Chất Lượng Chất Chuẩn Monotropein Và Nystose

- Dung dịch đối chiếu: Lấy chính xác 1 ml dung dịch thử và pha loãng thành 100 ml bằng MeOH.

Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 l mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi được khoảng ¾ bản mỏng, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí và phun thuốc thử hiện vết, sấy bản mỏng ở 110 ºC trong 3 phút.

Đánh giá: Quan sát bản mỏng ở ánh sáng thường, so sánh màu sắc, kích thước của vết phụ trên sắc ký đồ của dung dịch thử với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

2.3.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein và nystose

Căn cứ kết quả thực tế kiểm tra chất lượng nguyên liệu, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng monotropein và nystose, bao gồm các tiêu chí [24], [51], [80]:

- Mục đích sử dụng.

- Yêu cầu kỹ thuật: Định tính, mất khối lượng do làm khô, nhiệt độ nóng chảy,

định lượng, tạp chất liên quan.

2.3.3.3. Đóng lọ chuẩn

- Chuẩn bị lọ đóng chuẩn: Lọ thủy tinh màu nâu, thể tích 2 ml được rửa, sấy

khô.

- Khối lượng chuẩn trong 1 lọ: khoảng 20 mg

- Đóng ống chuẩn trong buồng sạch Glove Box Terra Universal được nạp khí

nitơ trơ, kiểm soát điều kiện nhiệt độ (khoảng 25 oC), độ ẩm (tương đương hoặc thấp

hơn độ ẩm của nguyên liệu) [24].

2.3.3.4. Đánh giá đồng nhất lô

- Lấy ngẫu nhiên 10 lọ chất chuẩn đã đóng gói, tiến hành xác định hàm lượng (tính theo nguyên trạng) của hoạt chất trong từng lọ, sử dụng phương pháp phân tích tại Mục 2.3.1.1 - a (đối với thiết lập chất chuẩn monotropein) và Mục 2.3.1.1 – b (đối với thiết lập chất chuẩn nystose) [24].

- Lô sản xuất được coi là đồng nhất khi giá trị RSD (%) của kết quả hàm lượng giữa các lọ được kiểm tra ≤ 1,0 %  Điều kiện đóng gói ổn định, mẫu nguyên liệu đóng trong các lọ là đồng nhất [24].

2.3.3.5. Đánh giá liên phòng thí nghiệm và công bố hàm lượng

- Áp dụng phương pháp định lượng tại Mục 2.3.1.1 - a (đối với thiết lập chất chuẩn monotropein) và Mục 2.3.1.1 – b (đối với thiết lập chất chuẩn nystose).

- Đánh giá trên 2 phòng thí nghiệm, mỗi phòng thí nghiệm nhận được chất chuẩn gốc và 06 lọ bán thành phẩm chất chuẩn.

- Kết quả phòng thử nghiệm 1: Lấy từ kết quả đánh giá đồng nhất lô.

- Kết quả phòng thử nghiệm 2: Lấy từ kết quả 6 thử nghiệm độc lập.

- Tập hợp kết quả của 2 KTN, tính kết quả công bố trến chứng chỉ [24].

2.3.3.6. Xử lý số liệu, đánh giá kết quả

- Xử lý kết quả giữa các phòng thử nghiệm, kiểm nghiệm viên: Áp dụng phân tích Student T-test khi số phòng thử nghiệm (kiểm nghiệm viên) tham gia bằng 2 (với α = 0,05) [24]:

+ Nếu Ttn< Ttc: Kết quả phân tích của 2 phòng thử nghiệm (kiểm nghiệm viên)

khác nhau không có ý nghĩa thống kê;

+ Nếu Ttn> Ttc: Kết quả phân tích của 2 phòng thử nghiệm (kiểm nghiệm viên) khác nhau có ý nghĩa thống kê → Xem xét kết quả, có thể đề nghị phòng thử nghiệm (kiểm nghiệm viên) có giá trị độ lệch chuẩn (S) lớn tiến hành lại thực nghiệm.

- Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối theo công thức sau [24]:

+ Tính giá trị trung bình:

𝑛

𝑋̅ = 1 ∑ 𝑥

+ Tính độ lệch chuẩn:

𝑛 𝑖

𝑖=1

∑𝑛(𝑥𝑖−𝑋̅)2

S=√

𝑖=1

𝑛

+ Tính độ lệch chuẩn tương đối:

RSD (%) = S × 100

X̅

- Tính độ không đảm bảo đo mở rộng của kết quả công bố trên chứng chỉ: Kết quả công bố trên chứng chỉ phân tích là giá trị trung bình từ tập hợp các kết quả phân tích với 16 phép thử (n > 10), độ không đảm bảo đo của giá trị này được tính theo loại A, với hệ số phủ k = 2 ở mức tin cậy 95 % [24].

U S x2

2.3.3.7. Nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn monotropein và nystose

a. Điều kiện bảo quản

- Chất chuẩn được bảo quản tại điều kiện 2 oC – 8 oC. b. Phương pháp nghiên cứu

* Phép thử định lượng [24]:

- Tiến hành thử nghiệm trên 06 thử của ít nhất 3 lọ khác nhau.

- Phương pháp thử theo Mục 2.3.1.1 - a (đối với định lượng monotropein) và

Mục 2.3.1.1 – b (đối với định lượng nystose).

- Yêu cầu: Hàm lượng chất chuẩn không sai khác quá 1,0 % so với hàm lượng chuẩn công bố; Giá trị (%) RSD  1,0 %.

* Phép thử xác định tạp chất [24]:

- Tiến hành kiểm tra trên 3 lọ (ống) mẫu thử riêng biệt

- Phương pháp thử theo Tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn.

- Yêu cầu: Hàm lượng tạp chất phải đạt theo yêu cầu của Tiêu chuẩn chất lượng.

2.3.3.8. Định tính, định lượng monotropein, nystose trong dược liệu rễ Ba kích.

a. Chuẩn bị mẫu thử

Dược liệu rễ Ba kích sau khi thu hái được rửa sạch, bỏ lõi, thái nhỏ, sau đó

nghiền thành bột mịn và cho rây qua rây 250 µm. b. Định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích

Sử dụng chất chuẩn monotropein mới thiết lập để định lượng monotropein trong

dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp HPLC – DAD tại Mục 2.3.1 – a. c. Định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích

Sử dụng chất chuẩn nystose mới thiết lập để định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp HPLC – ELSD tại Mục 2.3.1 – b.

2.3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN

2.3.4.1. Chiết tách ADN từ rễ Ba kích

* Bước 1: Lấy mẫu để tách DNA

Các mẫu rễ dược liệu tươi tại Bảng 2.1 được rửa sạch bằng nước, cắt nhỏ.

* Bước 2: Phá vỡ thành tế bào và nhân

- Mẫu dược liệu để trong tủ lạnh âm sâu tại nhiệt độ khoảng -80 oC trong 12 giờ.

Sau đó nghiền mẫu bằng cối sứ.

* Bước 3: Hòa tan DNA và loại bỏ tạp chất [44].

- Thêm 400 µl đệm AP1 và thêm 4 µl RNase. Lắc rung và ủ 10-15 phút ở 65

oC. Lắc khoảng 2-3 lần trong thời gian ủ.

- Thêm 130 µl đệm P3. Trộn đều và ủ 5 phút trong nước đá.

- Ly tâm 5 phút ở 14.000 vòng/phút.

- Thu dịch ly tâm cho vào cột ly tâm Qiashredder. Ly tâm 2 phút ở 14.000 vòng/phút.

- Thu dịch cho qua ống eppendorf mới. Thêm 1,5 thể tích đệm AW1, trộn đều.

- Lấy 650 µl hỗn dịch trên cho vào cột ly tâm Dneasy Mini, ly tâm 1 phút ở

8.000 vòng/phút, loại bỏ nước lọc. Tiếp tục với lượng hỗn dịch còn lại.

* Bước 4: Kết tủa DNA

- Chuyển cột ly tâm Dneasy Mini sang ống ly tâm (spin tube) mới. Thêm 500

µl đệm AW2, ly tâm 1 phút ở 8.000 vòng/phút, loại nước lọc.

- Thêm tiếp 500 µl đệm AW2, ly tâm 2 phút ở 14.000 vòng/phút.

- Chuyển cột ly tâm sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

- Thêm 100 µl đệm AE để hòa tan DNA. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (15 – 25

oC). Ly tâm 1 phút ở 8.000 vòng/phút.

* Bước 5: Kiểm tra ADN tách chiết

- Điện di trên gel

+ Gel agarose: Cân 0,3 g agarose vào 30 ml TBE 1X. Đun chảy. Để nguội 45

oC và đổ vào khuôn đã cài lược sẵn. Để gel đông ở nhiệt độ phòng.

+ Đệm điện di: Đệm TBE 10X được pha thành 1X.

+ Mẫu điện di: 3 µl Mẫu DNA tách chiết + 1 µl Loading dye + 2 µl Run safe.

+ Tiến hành: Cho đệm điện di vào buồng điện di sao cho ngập bản gel, hút 5 µl mẫu điện di vào giếng đã tạo sẵn. Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 50 mV trong 25 phút. Sau khi điện di, soi Bản gel trên máy soi gel ở bước sóng 302 nm.

- Đo mật độ quang

+ Tiến hành đo mật độ quang (A) dung dịch ADN tại bước sóng 260 nm (OD260

= 1 tương ứng với nồng độ ADN là 50 µg/ml) và bước sóng 280 nm [44].

+ Hàm lượng ADN được xác định bằng công thức: CDNA = OD260 x 50 x X (µg/ml) [44]

Trong đó: OD260: Mật độ quang tại bước sóng 260 nm.

X: là hệ số pha loãng dung dịch DNA.

- Độ tinh sạch của ADN được xác định bằng tỷ lệ OD260/OD230 và OD260/OD280. ADN được coi là tinh sạch khi các tỷ lệ trên lớn hơn 1,8 [46].

2.3.4.2. Nhân bản đoạn gen

* Khuếch đại gen

Khuếch đại các trình tự ITS, rcbL, trnH-pbsA, matK sử dụng các thành phần phản ứng có nồng độ như trong Bảng 2.5.

Bảng 2.5. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng

Stt

Thành phần phản ứng	Thể tích
1	10mmM dNTPs	0,4 µl
2	Phire Hot Start II DNA polymerase	0,4 µl
3	Buffer Phire 5x	4 µl
4	Mồi xuôi	0,5 µl
5	Mồi ngược	0,5 µl
6	Dịch chiết DNA	1-3 µl
7	Nước	Vừa đủ 23 µl

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

Các mồi chung được sử dụng để khuếch đại các trình tự ITS, rcbL, trnH-pbsA, matK như trong Bảng 2.6.

Bảng 2.6. Các mồi chung cho các trình tự ITS và các gen trên chloroplast

Tên mồi

Trình tự DNA	Tác giả	Vị trí trên gen
ITS1 - ITS4	TCCGTAGGTGAACCTGCGG	White et al. (1990) [84]	ITS1-5,8S- ITS2
	TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS U4- ITS P5	RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA	Tao Cheng et al. (2015) [36]	ITS1-5,8S- ITS2
	CCTTATCAYTTAGAGGAAGGAG
1326R- 390F	TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T	Cu´enoud et al. 2002 [39]	matK
	CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C
rcbLaF- rcbLaR	ATGTCACCACAAACAGAGACTAA AGC	Levin et al., modifi ed from Soltis et al. [56]	rcbL
	GTAAAATCAAGTCCACCRCG	Kress and Erickson, modified from Fofana et al. [54]
psbA- trnH	CGAAGCTCCATCTACAAATGG	Hamilton [48]	trnH-psbA

Chương trình chạy PCR: Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS1-ITS4 , ITS U4- ITS P5, matK 1326R-390F, rcbLaF-rcbLaR và trnH-pbsA được trình bày lần lượt tại Bảng 2.7, Bảng 2.8, Bảng 2.9, Bảng 2.10 và Bảng 2.11.

Bảng 2.7. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS1-ITS4 [84]

Các bước

Nhiệt độ (oC)	Thời gian	Số chu kỳ
Khởi đầu	98	5 phút	1
Biến tính	98	30 giây
Bắt cặp	55	40 giây	35
Kéo dài	72	1 phút
Kết thúc	72	10 phút	1

Bảng 2.8. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS U4-ITS P5 [36]

Các bước

Nhiệt độ (oC)	Thời gian	Số chu kỳ
Khởi đầu	98	5 phút	1
Biến tính	98	30 giây
Bắt cặp	55	40 giây	35
Kéo dài	72	1 phút
Kết thúc	72	10 phút	1

Bảng 2.9. Chương trình PCR cho đoạn mồi của matK 1326R-390F [39]

Các bước

Nhiệt độ (oC)	Thời gian	Số chu kỳ
Khởi đầu	98	5 phút	1
Biến tính	98	30 giây
Bắt cặp	50	40 giây	35
Kéo dài	72	40 giây
Kết thúc	72	5 phút	1

Bảng 2.10. Chương trình PCR cho đoạn mồi của rcbLaF-rcbLaR [54], [56]

Các bước

Nhiệt độ (oC)	Thời gian	Số chu kỳ
Khởi đầu	98	5 phút	1
Biến tính	98	15 giây
Bắt cặp	55	30 giây	35
Kéo dài	72	40 giây
Kết thúc	72	10 phút	1

Bảng 2.11. Chương trình PCR cho đoạn mồi của trnH-pbsA [48]

Các bước

Nhiệt độ (oC)	Thời gian	Số chu kỳ
Khởi đầu	98	5 phút	1
Biến tính	98	15 giây
Bắt cặp	64	30 giây	35
Kéo dài	72	40 giây
Kết thúc	72	10 phút	1

Mỗi phản ứng PCR được lặp lại ít nhất 3 lần.

* Kiểm tra kết quả khuếch đại gen bằng phương pháp điện di

- Gel agarose: Cân 0,3 g agarose vào 30 ml TBE 1X. Đun chảy. Để nguội 45 oC

và đổ vào khuôn đã cài lược sẵn. Để gel đông ở nhiệt độ phòng.

- Đệm điện di: Cho Đệm TBE 10X được pha thành 1X.

- Mẫu điện di: 3 µl sản phẩm PCR + 1 µl Loading dye + 2 µl Run safe.

- Tiến hành: Cho đệm điện di vào buồng điện di sao cho ngập bản gel, hút 5 µl mẫu điện di vào giếng đã tạo sẵn. Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 50 mV trong 25 phút. Sau khi điện di, soi Bản gel trên máy soi gel ở bước sóng 302 nm.

2.3.4.3. Giải trình tự đoạn gen và định danh dược liệu

Pha loãng sản phẩm PCR bằng cách thêm 15 µl đệm điện di vào mỗi giếng. Ly tâm. Dùng các đoạn mồi tương tự như trong phản ứng PCR. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng trong quá trình giải trình tự gen được trình bày tại Bảng 2.12.

Bảng 2.12. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng giải trình tự đoạn gen

Stt

Thành phần phản ứng	Thể tích (µl)
1	5X Sequencing Buffer	1,875
2	10 μM primer	1
3	BigDye	0,250
4	Nước	5,875
5	Diluted DNA	2

Chương trình giải trình tự: 94 °C trong 10 giây; 35 chu kỳ bao gồm 94 °C trong 20 giây, 50 °C trong 20 giây, 60 °C trong 4 phút.

* Phân tích dữ liệu:

- Sau khi giải trình tự, đọc và kết nối các trình tự bằng phần mềm DNASTAR

[43].

- So sánh các trình tự với ngân hàng gen trên NCBI bằng công cụ BLAST.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) là công cụ tìm các vị trí tương đồng cục bộ giữa các trình tự sinh học DNA, được phát triển bởi NCBI. BLAST tìm kiếm giữa chuỗi truy vấn với chuỗi có trong CSDL bằng phương pháp heurictic, giải thuật Smith-Waterman [28].

- Xếp hàng và so sánh trình tự, so sánh khoảng cách di truyền bằng công cụ MEGA 6.0 [78].

2.3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính, định lượng

- Chỉ tiêu định tính:

+ Định tính monotropein bằng phương pháp HPLC - DAD.

+ Định tính nystose bằng phương pháp TLC; HPLC - ELSD.

- Chỉ tiêu định lượng:

+ Định lượng monotropein bằng phương pháp HPLC - DAD.

+ Định lượng nystose bằng phương pháp HPLC - ELSD.