Trang chủ / Tài liệu miễn phí / Luận Án Tiến Sĩ Dược Học

Sơ Đồ Phân Lập, Tinh Chế Nystose Từ Cao Chiết Nước



2,5 lít nước ấm

Dịch chiết nước

Sắc ký cột diaion HP-20

Methanol – nước (25 : 75)


B2


Cột chứa than hoạt tính


Sắc ký cột Sephadex LH-20

Nước – Methanol (10:1)


Sắc ký cột silica gel

Isopropanol – Ethanol - nước (3:2:1)


Kết tinh lại 10 lần

Ethanol 20 %

Nystose (2,21 g)

Cao chiết nước (250 g)

MO10.3

MO11.1

MO11.2

MO11.3

MO12.2

MO11.4

Ethanol 20 %

Hình 3.8. Sơ đồ phân lập, tinh chế nystose từ cao chiết nước

3.2.4. Xác định bộ dữ liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn

3.2.4.1. Nguyên liệu monotropein

- Tinh thể hình kim màu trắng,

- Nhiệt độ nóng chảy 173 - 175 ºC.

- Phổ NMR (Phụ lục 3)

Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 7,42 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-3); 6,24 (1H, dd, J = 2,5; 5,5 Hz, H-6); 5,64 (1H, dd, J = 2,0; 5,5 Hz, H-7); 5,61 (1H, d, J = 3,0 Hz,

H-1); 4,69 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′); 3,89 (1H, d, J = 12,0 Hz; H-6′a); 3,70 (1H, dd,

J = 4,0; 12,0 Hz, H-6′b); 3,59 (2H, m, H-10); 3,56 (1H, m, H-5); 3,40 (1H, m, H-2′);

3,23 (1H, dd, J = 8,0; 9,0 Hz, H-4′); 2,72 (1H, dd, J = 3,0; 9,0 Hz, H-9).

13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): δC 37,8 (C-5); 44,3 (C-9); 61,2 (C-6′); 67,1 (C-

10); 70,1 (C-4′); 73,3 (C-2′); 76,6 (C-3′); 76,9 (C-5′); 84,6 (C-8); 93,9 (C-1′); 98,7

(C-1); 109,8 (C-4); 132,3 (C-7); 136,6 (C-6); 151,1 (C-3); 169,2 (C-11).

- Phổ hồng ngoại IR (KBr): νmax 3388, 1693, 1643, 1441, 1295, 1027 cm-1.

- Phổ khối lượng: Xác định phổ khối ESI-, kết quả cho mảnh phổ m/z = 389,0 [M – H]– (Phụ lục 3).

Qua kết quả phân tích phổ NMR (1H NMR, 13C NMR), phổ hồng ngoại và phổ khối, các số liệu phổ chi tiết đã được xây dựng, đưa ra là chính xác và hoàn toàn phù hợp với cấu trúc phân tử của monotropein, công thức cấu tạo như Hình 3.9.



Hình 3.9. Công thức cấu tạo của monotropein


3.2.4.2. Nguyên liệu nystose

- Tinh thể hình kim màu trắng,

- Nhiệt độ nóng chảy: 134 - 135 ºC.

- Kết quả đo phổ NMR (Phụ lục 4) được trình bày tại Bảng 3.13 và Bảng 3.14.

Bảng 3.13. Số liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) của chất phân tích và tham khảo

*(D2O, 600 MHz)


Vị trí

Nystose (δH ppm)

*Nystose (δH ppm) [81]

Glu

Fru-1

Fru-2

Fru-3

*Glu

*Fru-1

*Fru-2

*Fru-3

H-1a

5,40

3,84

3,85

3,75

5,43

3,84

3,86

3,75

H-1b

-

3,73

3,72

3,66

-

3,74

3,72

3,68

H-2

3,49

-

-

-

3,54

-

-

-

H-3

3,74

4,23

4,18

4,14

3,75

4,27

4,22

4,18

H-4

3,42

4,00

4,03

4,06

3,47

4,04

4,07

4,10

H-5

3,84

3,84

3,83

3,83

3,83

3,87

3,86

3,86

H-6a

3,80

3,81

3,82

3,84

3,81

3,81

3,82

3,84

H-6b

3,80

3,78

3,74

3,74

3,81

3,79

3,75

3,75

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

Bảng 3.14. Số liệu phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz) của chất phân tích và tham khảo

*(D2O, 100 MHz)


Vị trí

Nystose (δC ppm)

*Nystose (δC ppm) [81]

Glu

Fru-1

Fru-2

Fru-3

*Glu

*Fru-1

*Fru-2

*Fru-3

C-1

92,5

62,3

61,1

62,2

93,8

62,4

62,2

61,7

C-2

71,2

103,3

103,1

103,7

72,5

104,5

104,3

105,0

C-3

73,9

77,5

76,8

76,8

73,9

78,1

78,8

78,1

C-4

69,3

72,5

74,4

74,5

70,5

75,2

75,6

75,7

C-5

72,6

81,3

81,1

81,1

73,7

82,5

82,4

82,4

C-6

60,2

62,3

60,9

60,5

61,4

63,5

63,5

63,5

- Phổ hồng ngoại IR (KBr): νmax 3406, 1652, 1458, 1325, 1132, 1059, 999 cm-1

(Phụ lục 4).

- Phổ khối lượng: Xác định phổ khối ESI+, kết quả cho mảnh phổ m/z = 689,3 [M + Na]+ (Phụ lục 4).

Qua kết quả phân tích phổ NMR (1H NMR, 13C NMR), phổ hồng ngoại và phổ khối, các số liệu phổ chi tiết đã được xây dựng, đưa ra là chính xác và hoàn toàn phù hợp với cấu trúc phân tử của nystose, công thức cấu tạo như Hình 3.10.



Hình 3.10. Công thức cấu tạo của nystose


3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose

3.3.1. Thiết lập chất chuẩn monotropein

3.3.1.1. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu monotropein

* Định tính

- Phổ IR: Nguyên liệu monotropein cho phổ IR tương ứng với phổ IR của monotropein chuẩn và có các đỉnh đặc trưng: 3388, 1693, 1643, 1441, 1295, 1027 cm-1.

- Trong mục định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic monotropein thu được từ dung dịch chuẩn (7,2 phút).

* Mất khối lượng do làm khô

Tiến hành theo qui trình tại Mục 2.3.3.1 – a, kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu monotropein được trình bày tại Bảng 3.15.

Bảng 3.15. Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu monotropein


Stt

Lượng cân (mg)

Mất khối lượng do làm khô (%)

1

5,133

1,25

2

5,048

1,28

3

5,067

1,24

Trung bình

1,26

* Nhiệt độ nóng chảy

Tiến hành theo Phụ lục 6.7 – DĐVN V.

Kết quả nhiệt độ nóng chảy: 173 - 175 ºC.

* Định lượng monotropein

Kết quả tại Bảng 3.3 của mục khảo sát độ lặp lại trong Mục 3.1.1.3, hàm lượng monotropein trong nguyên liệu là 98,06 %.

* Tạp chất liên quan monotropein

Tiến hành theo qui trình tại Mục 2.3.3.1 – a, Kết quả xác định tạp chất liên quan có trong nguyên liệu monotropein được trình bày tại Hình 3.11 và Bảng 3.16.

a Mẫu trắng b Dung dịch đối chiếu c Dung dịch thử Hình 3 11 Sắc ký đồ tạp 1

(a) Mẫu trắng


b Dung dịch đối chiếu c Dung dịch thử Hình 3 11 Sắc ký đồ tạp chất liên quan 2

(b) Dung dịch đối chiếu

c Dung dịch thử Hình 3 11 Sắc ký đồ tạp chất liên quan monotropein Bảng 3 16 3

(c) Dung dịch thử

Hình 3.11. Sắc ký đồ tạp chất liên quan monotropein


Bảng 3.16. Kết quả xác định tạp chất trong nguyên liệu monotropein



Stt


Lượng cân (mg)

Diện tích pic tạp (mAU.s)

Diện tích pic monotropein trong dung dịch

đối chiếu(mAU.s)

(%) Tạp

Pic 5,0

Pic 11,5

Pic 5,0

Pic 11,5

Tổng

1

10,42

5212

88542

525551

0,01

0,17

0,17

2

10,48

5257

90668

511465

0,01

0,18

0,18

3

10,52

5515

93107

512363

0,01

0,18

0,18

Trung bình

-

0,18

0,18

Trên sắc ký đồ dung dịch thử ngoại trừ pic monotropein và pic dung môi thì xuất hiện 2 pic phụ tại thời gian lưu 5,0 phút và 11,5 phút; Pic phụ tại thời gian lưu 5,0 phút có diện tích bằng 0,01 % (< 0,05 %) so với diện tích pic monotropein trong dung dịch thử tương ứng, nên không là pic tạp chất. Như vậy, nguyên liệu monotropein xuất hiện 1 pic tạp chất tại thời gian lưu 11,5 phút với hàm lượng tạp chất tương ứng 0,2 %.

3.3.1.2. Tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein

Tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropepin được trình bày tại Phụ lục 11 và bản tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng được trình bày tại Bảng 3.17.

Bảng 3.17. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein


Stt

Chỉ tiêu

Yêu cầu

Phương pháp thử

1

Mô tả

Chế phẩm dạng bột kết tinh màu trắng

Cảm quan

2

Định tính




- Phổ hồng ngoại (IR)

Phù hợp với phổ IR của monotropein chuẩn và có các đỉnh đặc trưng: 3388,

1693, 1643, 1441, 1295, 1027 cm-1

Phổ hồng ngoại,

phương pháp KBr


- HPLC-DAD

Sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic monotropein trên

sắc ký đồ dung dịch chuẩn

Phương pháp định lượng

3

Mất khối

lượng do làm khô

2,0 %

Phương pháp phân

tích nhiệt trọng

lượng

4

Nhiệt độ nóng

chảy

173 - 175 ºC

Phụ lục 6.7 –

DĐVN V

5

Định lượng

97,0 % monotropein (C16H22O11), tính theo nguyên trạng

Phương pháp

HPLC – DAD

6

Tạp chất liên

quan

- Từng tạp: ≤ 0,5 %

- Tổng tạp: ≤ 1,0 %

Phương pháp

HPLC – DAD

3.3.1.3. Đóng lọ chuẩn

Điều kiện đóng lọ:

- Độ ẩm: 2,0 %.

- Nhiệt độ: 24,9 oC - 27,8 oC

Kết quả đóng lọ chất chuẩn monotropein được trình bày tại Bảng 3.18.

Bảng 3.18. Số lượng lọ chuẩn monotropein


Nội dung

Số lọ chất chuẩn monotropein

Tổng số lọ ban đầu

84

Đánh giá đồng nhất lô

10

Đánh giá liên phòng thí nghiệm

06

Nghiên cứu độ ổn định

12

Còn lại

56

3.3.1.4. Đánh giá đồng nhất lô

Tiến hành theo phương pháp tại Mục 2.3.3.4.

- Lượng cân chất chuẩn monotropein: 10,48 mg. Diện tích píc monotropein trong dung dịch chuẩn: 803216 mAU.s

Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn monotropein được trình bày tại Bảng

3.19.


Bảng 3.19. Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn monotropein


Stt

Lượng cân (mg)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (%)

1

9,25

701119

97,91

2

10,35

794142

99,11

3

10,41

794467

98,58

4

10,48

804061

99,10

5

10,29

792677

99,51

6

10,46

797498

98,48

7

10,68

803739

97,21

8

10,38

794051

98,81

9

10,56

804666

98,43

10

10,41

802051

99,52

Trung bình

98,67

RSD (%)

0,73

Độ lệch chuẩn tương đối của 10 lọ bán thành phẩm chất chuẩn monotropein (RSD) là 0,73 % (< 1,0 %). Như vậy, điều kiện đóng gói ổn định, mẫu nguyên liệu đóng trong các lọ là đồng nhất.

3.3.1.5. Đánh giá liên phòng thí nghiệm và công bố hàm lượng

Tiến hành theo phương pháp tại Mục 2.3.3.5.

- Lượng cân chất chuẩn monotropein: 10,42 mg. Diện tích píc monotropein trong dung dịch chuẩn: 3097656 mAU.s

Kết quả đánh giá liên phòng thí nghiệm chất chuẩn monotropein được trình bày tại Bảng 3.20.

Bảng 3.20. Kết quả đánh giá liên phòng chất chuẩn monotropein


Stt

Lượng cân (mg)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (%)

1

10,61

3126195

98,69

2

10,52

3079503

98,05

3

10,62

3130690

98,74

4

10,58

3115681

98,63

5

10,46

3076036

98,50

6

10,68

3123461

97,96

Trung bình

98,43

RSD (%)

0,35

* Tập hợp kết quả phân tích, xác định hàm lượng chất chuẩn monotropein

Tiến hành theo Mục 2.3.3.6. Kết quả student t-test có giá trị tTN = 0,894 (< tLT = 1,761) với xác xuất 95% (Phụ lục 7). Như vậy, kết quả phân tích của các phòng thí nghiệm khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

Kết quả phân tích xác định hàm lượng chất chuẩn monotropein công bố trên chứng chỉ được trình bày tại Bảng 3.21.

Bảng 3.21. Kết quả hàm lượng chất chuẩn monotropein


Stt

Xi (%)

Stt

Xi (%)

Stt

Xi (%)

Stt

Xi (%)

1

97,21

5

98,43

9

98,63

13

99,10

2

97,91

6

98,48

10

98,69

14

99,11

3

97,96

7

98,50

11

98,74

15

99,51

4

98,05

8

98,58

12

98,81

16

99,52

Trung bình

98,58 %

Độ lệch chuẩn (SD)

0,60 %

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

0,61 %

Độ không đảm bảo đo (U)

0,30 %

Ghi nhãn chất chuẩn:

- Chuẩn Dược điển Việt Nam: Monotropein

- Số kiểm soát: 0119.C005.01

- Hàm lượng chất chuẩn monotropein: 98,58 % C16H22O11 (nguyên trạng).

- Độ không đảm bảo đo mở rộng: U = ± 0,30 %; hệ số phủ k = 2 ở độ tin cậy 95 %.

Xem tất cả 226 trang.

Ngày đăng: 20/04/2024
Trang chủ Tài liệu miễn phí