Thẩm Định Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Monotropein Và Nystose

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu dược liệu (có độ tuổi trên 3 năm) được thu hái trong các vùng Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Hà Giang, được mã hoá tại Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Danh mục mã hoá các mẫu Ba kích

Stt

Mã hoá	Nơi thu hái	Số hiệu tiêu bản	Nơi lưu mẫu
1	BK1	Lục Ngạn, Bắc Giang	2018.DT02.BK1	Khoa Kiểm
2	BK2	Vị Xuyên, Hà Giang	2018.DT02.BK2	nghiệm Đông
				dược dược
3	BK3	Vân Đồn, Quảng Ninh	2018.DT02.BK3
				liệu – Viện
4	BK4	Hoành Bồ, Quảng Ninh	2018.DT02.BK4
				Kiểm nghiệm
5	BK5	Tây Giang, Quảng Nam	2018.DT02.BK5
				thuốc Trung
6	BK6	Quản Bạ, Hà Giang	2018.DT02.BK6	ương

Có thể bạn quan tâm!

• Tóm Tắt Chuyên Luận Dược Liệu Rễ Ba Kích Trong Dược Điển
• Tình Hình Thiết Lập Chất Chuẩn Monotropein Và Nystose
• Sơ Đồ Và Các Chu Kỳ Của Phản Ứng Chuỗi Polymerase [15]
• Nội Dung Thẩm Định Phương Pháp Định Lượng Nystose [52]
• Xây Dựng Tiêu Chuẩn Chất Lượng Chất Chuẩn Monotropein Và Nystose
• Thẩm Định Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Monotropein

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

- Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose trên mẫu BK4. Nguyên liệu thu được của quá trình này dùng để thiết lập chất chuẩn.

- Đối tượng nghiên cứu để định danh dược liệu rễ Ba kích bằng chỉ thị ADN là 6 mẫu dược liệu thu hái theo Bảng 2.1.

2.2. Phương tiện nghiên cứu

2.2.1. Chất chuẩn và dược liệu chuẩn

- Chất chuẩn monotropein: Nguồn gốc: Sigma Aldrich; Số lô: SLBN8437V;

Hàm lượng: 99 % C16H22O11 (nguyên trạng).

- Chất chuẩn nystose: Nguồn gốc: Sigma Aldrich; Số lô: BCBT3105; Hàm

lượng: 99,6 % C24H42O21 (nguyên trạng).

- Dược liệu chuẩn Ba kích (Morinda officinalis How, họ cà phê (Rubiaceae)): Nguồn gốc: Viện kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm Trung ương Trung Quốc; Số lô: 121163-201405.

2.2.2. Hóa chất và thuốc thử

- Methanol, ethanol, n-hexan, ethyl acetat, dichloromethan, aceton, acid trichloacetic, acid acetic, acid chlohydric, amoniac, chloroform... (hãng Merck).

- Bản mỏng pha đảo, bản mỏng pha thuận, silica gel sắc ký cột (hãng Merck, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm).

- Mồi chung cho phản ứng PCR, 40 - 50 nucleotid/cặp

- Kit chiết tách Dneasy mini plant kit (Qiagen - Mỹ)

- Thang ADN (DNA ladder) 1000 µl/lọ - Mỹ

- Taq polymerase (500 unit/lọ)

- Dung dịch dNTPs 10mM - Mỹ

- Kit nhân dòng - Mỹ

- Ethidium bromide (lọ 10ml)- Sigma

- Đệm TBE 1X: 89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA pH 8,3 ± 0,2 (Thermo Scientific – Mỹ).

- Agarose (Thermo Scientific – Mỹ).

- Thuốc nhuộm gel Runsafe Stain: Bromophenol Blue, Xylene Cyanol FF, Orange G (Clever Scientific – Anh).

- Loading dye: 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA, 0,005 % bromophenol blue, 0,005 % xylen cyano FF, 10 % glycerol (Thermo Scientific – Mỹ).

2.2.3. Thiết bị, dụng cụ

- Bộ sắc ký cột thuỷ tinh.

- Buồng đóng chuẩn Terra Universal, model: Glove Series 400 Glovebox

- Cân phân tích: Mettler Toledo MS105 (d = 0,01 mg); Mettler Toledo AB204 (d = 0,1 mg).

- Máy định lượng DNA Biophotometer plus.

- Máy đo điểm chảy Buchi 535 Melting point.

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AM500 FT-NMR.

- Máy đo quang phổ hồng ngoại Thermo Nicolet Nexus 670 FTIR.

- Máy đo UV – VIS Hitachi UV 3210.

- Máy giải trình tự gen AIB 3130XL.

- Máy PCR AB Aplied BioSystems Veriti.

- Máy phân tích nhiệt trọng lượng TGA Mettler Toledo.

- Máy sắc ký lỏng điều chế Shimadzu LC 10 AT VP, detector PDA.

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Detector DAD Shimadzu LC 20A.

- Máy Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector ELSD Hitachi.

- Máy soi gel UV transilluminator.

- Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) Waters QTOF

- Các dụng cụ và thiết bị phụ trợ khác.

Các thiết bị đều được hiệu chuẩn theo qui định của ISO/IEC 17025 và GLP.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose

2.3.1.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein

a. Phương pháp định tính, định lượng monotropein

Qua tham khảo tài liệu [49], [57] và kết quả khảo sát thực tế, phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và trong dược liệu rễ Ba kích được tiến hành với các điều kiện như sau:

* Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Phenomenex Gemini RP 18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm)

- Pha động: Hỗn hợp dung môi MeOH : Acid phosphoric 0,5 % theo tỷ lệ thể tích 5 : 95

- Detector DAD: Bước sóng UV tại 237nm

- Tốc độ dòng: 1ml/phút.

- Thể tích tiêm: 10 µl.

- Nhiệt độ phân tích: 25 oC.

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn monotropein, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng MeOH. Lấy chính xác 1 ml dung dịch pha loãng và định mức thành 20 ml bằng nước.

* Chuẩn bị dung dịch thử

- Dung dịch thử (Định lượng monotropein trong nguyên liệu): Cân chính xác khoảng 10 mg nguyên liệu monotropein, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng MeOH. Lấy chính xác 1 ml dung dịch pha loãng và định mức thành 20 ml bằng nước.

- Dung dịch thử (Định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích): Cân chính xác khoảng 0,6 g bột dược liệu rễ Ba kích vào ống ly tâm thủy tinh có nắp, thêm 15 ml EtOH 40 %, đậy nắp, lắc siêu âm 30 phút, ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Tiếp tục chiết tiếp 2 lần, mỗi lần 10 ml EtOH 40 %. Gộp các dịch chiết và định mức thành 50 ml dung dịch bằng EtOH 40%. Lấy chính xác 1 ml dung dịch pha loãng và định mức thành 10 ml bằng nước.

* Độ thích hợp của hệ thống sắc ký

Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic monotropein thu được từ 6 lần tiêm lặp lại dung dịch dịch chuẩn không quá 2,0 %. Số đĩa lý thuyết tính trên pic monotropein không dưới 4.000. Hệ số đối xứng của pic monotropein phải từ 0,8 – 1,5.

* Tính toán kết quả

- Hàm lượng (%) monotropein (C16H22O11) trong nguyên liệu được tính theo công thức:

𝑋 (%) = 𝑆𝑇×𝑚𝐶× 𝑃

trong đó:

𝑆𝐶 𝑚𝑇

ST, SC: diện tích pic monotropein trên sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng.

mT, mC: khối lượng cân mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng (mg). P: hàm lượng (%) chuẩn monotropein

- Hàm lượng monotropein (%) trong dược liệu rễ Ba kích (tính theo dược liệu khô kiệt) được tính theo công thức:

trong đó:

𝑋 (%) =

𝑆𝑡

×

𝑆𝑐

𝐶𝑐

𝑊

× 500 ×

100

×

(100 − 𝐴)

1

1000

× 100

ST, SC: diện tích pic monotropein trên sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng.

CC: nồng độ dung dịch chuẩn monotropein (mg/ml). W: lượng cân của mẫu thử (g).

A: độ ẩm của mẫu thử (%).

b. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và

dược liệu rễ Ba kích

Tiến hành thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp HPLC-DAD dựa trên các chỉ tiêu tại Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Nội dung thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein [52]

Chỉ tiêu

Cách xác định/đánh giá	Giới hạn chấp nhận
Độ thích hợp của hệ thống	Hiệu lực phân tách của cột	Số đĩa lý thuyết (N) ≥ 4.000
	Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu, diện tích pic monotropein trong dung dịch chuẩn	RSD ≤ 2,0 % (n = 6)
Độ đặc hiệu	Thời gian lưu của pic monotropein trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử.	Thời gian lưu tương ứng
	Độ tinh khiết của pic chính	~ 1
	Sắc ký đồ dung dịch mẫu dung môi	Không cho pic tại thời gian lưu của pic monotropein
Độ tuyến tính	Hệ số tương quan	r ≥ 0,995
Độ chính xác
Độ lặp lại	Giá trị RSD kết quả định lượng	RSD ≤ 2,0 % (n = 6)
Độ chính xác trung gian	Xác định giá trị RSD kết quả định lượng	RSD ≤ 2,0 % (n = 6)
	Tập hợp kết quả độ lặp lại và khác ngày	RSD ≤ 2,0 % (n = 12)
Độ đúng	Xác định tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn monotropein trong các dung dịch tự tạo có mức nồng độ tương ứng 80%, 100% và 120% so với nồng độ định lượng.	98,0 % - 102,0 % RSD ≤ 2,0% (n = 9)
LOD, LOQ		Kết quả thực nghiệm

Phương pháp tiến hành

Độ thích hợp của hệ thống

Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Xác định độ lặp lại của thời gian lưu, diện tích pic monotropein và số đĩa lý thuyết.

Độ đặc hiệu

- Mẫu trắng (dung môi): Nước cất.

- Dung dịch chuẩn, dung dịch thử: Tiến hành theo Mục 2.3.1.1 – a – Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử.

Tiến hành sắc ký lần lượt các dung dịch chuẩn, dung dịch thử, dung môi vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ.

Độ tuyến tính

- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn monotropein,

hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng MeOH.

- Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng bằng nước để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ monotropein lần lượt bằng 20%, 60%, 100%, 140% và 200% so với nồng độ định lượng.

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn trên, ghi lại sắc ký đồ. Xây dựng đường hồi qui tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ monotropein trong các dung dịch chuẩn. Xác định hệ số tương quan tuyến tính (r).

Độ chính xác

Độ lặp lại:

- Sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính của mục Độ tuyến tính.

- Dung dịch thử: Chuẩn bị 6 dung dịch thử theo phương pháp nêu tại Mục 2.3.1.1

– a – Chuẩn bị dung dịch thử.

Xác định hàm lượng monotropein trong 6 dung dịch thử, tính độ lệch chuẩn

tương đối của 6 giá trị hàm lượng. Độ chính xác trung gian

Tiến hành tương tự như phần độ lặp lại nhưng khác ngày, khác người thử nghiệm. Tính độ lệch chuẩn tương đối của 6 kết quả định lượng khác ngày và 12 kết quả định lượng của độ lặp lại và khác ngày.

Độ đúng

* Định lượng monotropein trong nguyên liệu: Sử dụng phương pháp mẫu tự tạo.

- Dung dịch chuẩn: Tiến hành theo Mục 2.3.1.1 – a – Chuẩn bị dung dịch chuẩn.

- Dung dịch 80%: Cân chính xác khoảng 8 mg chuẩn monotropein, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng MeOH. Lấy chính xác 1 ml dung dịch pha loãng thành 20 ml bằng nước. Tiến hành trên 3 mẫu.

- Dung dịch 100%: Cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn monotropein, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng MeOH. Lấy chính xác 1 ml dung dịch pha loãng thành 20 ml bằng nước. Tiến hành trên 3 mẫu.

- Dung dịch 120%: Cân chính xác khoảng 12 mg chuẩn monotropein, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng MeOH. Lấy chính xác 1 ml dung dịch pha loãng thành 20 ml bằng nước. Tiến hành trên 3 mẫu.

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu tự tạo, ghi lại sắc ký

đồ. Xác định tỷ lệ thu hồi của monotropein trong 9 dung dịch mẫu tự tạo.

* Định lượng monotropein trong dược liệu: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn.

- Dung dịch chuẩn: Tiến hành theo Mục 2.3.1.1 – a – Chuẩn bị dung dịch chuẩn.

- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 50 mg chuẩn monotropein, hoà

tan và định mức thành 50 ml dung dịch bằng MeOH.

- Chuẩn bị các mẫu thử:

+ Thêm chính xác 3 ml, 5 ml, 7 ml dung dịch chuẩn gốc vào ống ly tâm thủy tinh có nắp đã chứa sẵn khoảng 0,3 g bột dược liệu rễ Ba kích, thêm 15 ml EtOH 40

%, đậy nắp, lắc siêu âm 30 phút, ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch chiết vào bình định mức 50 ml, cắn còn lại đem chiết tiếp 2 lần, mỗi lần với 10 ml EtOH 40 %, gộp các dịch chiết vào bình định mức trên, bổ sung EtOH 40 % đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 1 ml dung dịch trên và pha loãng và định mức thành 10 ml bằng nước.

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu tự tạo, ghi lại sắc ký

đồ. Xác định tỷ lệ thu hồi của monotropein trong 9 dung dịch mẫu thêm chuẩn.

Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có nồng độ monotropein tương ứng với 2 % so với nồng độ định lượng. Pha loãng dung dịch chuẩn này để được các dung dịch chuẩn có nồng độ monotropein bằng 1/2 để được các dung dịch chuẩn có nồng độ monotropein tương ứng với 1 %, 0,5 %, 0,25 % so với nồng độ định lượng.

Tiến hành tiêm dung dịch mẫu dung môi (nước) và các dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Xác định tỷ lệ đáp ứng pic monotropein so với độ nhiễu của đường nền để xác định LOD. Sau đó pha dung dịch có nồng độ gấp 3,3 lần LOQ, tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần để xác định RSD (%) của thời gian lưu, diện tích pic monotropein. Yêu cầu RSD (%)  2,0 %.

2.3.1.2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và

dược liệu rễ Ba kích

a. Phương pháp định tính, định lượng nystose

Qua tham khảo tài liệu [37], [47] và kết quả khảo sát thực tế, phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và trong dược liệu rễ Ba kích được tiến hành với các điều kiện như sau:

* Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: RP18 Ultra (250 mm x 4,6 mm, 5 µm).

- Pha động: MeOH - Nước (3 : 97).

- Detector ELSD: Nhiệt độ hoá hơi: 90 ºC; Độ phát hiện: Gain 6; Áp suất khí

nitơ: 3,5 bar.

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

- Thể tích tiêm: 10 µl.

* Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn nystose, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng pha động. Lấy chính xác 4 ml dung dịch, pha loãng và định mức thành 10 ml bằng pha động.

- Dung dịch thử (Định lượng nystose trong nguyên liệu): Cân chính xác khoảng 10 mg nguyên liệu nystose, hòa tan và định mức thành 25 ml dung dịch bằng pha động.