Thẩm Định Phương Pháp Định Tính Nystose Trong Dược Liệu Bằng Tlc

thuốc thử hiện màu, dung dịch chuẩn theo phương pháp định tính nystose trong chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông [47]. Luận án không tiến hành thẩm định phương pháp riêng biệt mà kết hợp tiến hành kiểm tra chất lượng nguyên liệu nystose. Trên sắc ký đồ thu được cho thấy: Dung dịch thử MO12.2 – phân đoạn trong quá trình tinh chế nystose từ dược liệu rễ Ba kích (dung dịch thử 4 và 5) cho 2 vết phụ (Rf : 0,33 và 0,81) tách tốt với vết chính (Rf = 0,56) và có màu sắc, kích thước đậm hơn và lớn hơn so với vết của dung dịch đối chiếu tương ứng (> 1 %). Các dung dịch thử đều cho vết chính có vị trí tương ứng với vị trí của vết nystose trong dung dịch chuẩn (Rf = 0,56). Dung môi không cho vết có vị trí tương ứng với vết nystose và các vết phụ của dung dịch thử MO12.2. Do đó, phương pháp có tính đặc hiệu với các tạp chất của nystose. Dung dịch đối chiếu 1 cho vết có vị trí, màu sắc lặp lại trong 6 lần chấm. Như vậy, phương pháp SKLM có độ đặc hiệu và lặp lại tốt, phù hợp để xác định tạp chất liên quan không định danh trong nguyên liệu nystose.

4.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu bằng TLC

Luận án tham khảo phương pháp TLC để định tính nystose trong dược liệu của Bộ tiêu chuẩn dược liệu chuẩn Hồng Kông [47]. Kết quả thẩm định độ đặc hiệu cho thấy phương pháp phù hợp để định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích tại Việt Nam.

4.2. Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích

4.2.1. Chiết cao toàn phần

Dựa vào độ tan khác nhau của monotropein và nystose trong MeOH và nước (nystose tan trong nước tốt hơn monotorpein), luận án lựa chọn phương pháp tạo cao chiết MeOH trước (có chứa iridoid toàn phần), sau đó gom bã Ba kích còn lại để chiết với nước tạo thành cao chiết nước (chứa nystose).

Một số công trình nghiên cứu sử dụng EtOH 30 % để chiết xuất monotropein từ dược liệu rễ Ba kích, tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là độ tinh khiết của sản phẩm không cao (hàm lượng monotropein 92,54 %) [61]. Dựa vào đặc tính tan

tốt trong MeOH của monotropein, MeOH được lựa chọn làm dung môi MeOH chiết monotropein từ dược liệu rễ Ba kích.

Với cao chiết MeOH, luận án sử dụng phương pháp chiết siêu âm ở nhiệt độ phòng, đây là phương pháp phổ thông đơn giản, chi phí thấp, dễ triển khai. Với cao chiết nước, luận án sử dụng phương pháp chiết bằng đun sôi hồi lưu trong 3 giờ để kéo nystose từ dược liệu và cô quay dưới áp suất giảm để thu được cao chiết nước có chứa nystose.

Trong quá trình cô quay chân không, nhiệt độ không quá 60 oC để tránh làm biến đổi các hợp chất trao đổi thứ cấp có trong dịch chiết.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

4.2.2. Phân lập, tinh chế monotropein

Trong cao chiết MeOH sẽ có iridoid, anthraquinon và một số thành phần khác tan trong MeOH. Giai đoạn chiết phân đoạn cao chiết MeOH với n-hexan và ethyl acetat sẽ loại được các thành phần hoá học khác tan trong dung môi này (ví dụ như anthraquinon tan tốt trong ethyl acetat), dịch chiết nước chứa monotropein và hỗn hợp các iridoid do tính tan trong nước của các thành phần này.

Diaion HP 20 hoạt động chủ yếu theo cơ chế phân bố. Mẫu thử sẽ được phân bố trong pha tĩnh (là nước, chiếm khoảng 60% khối lượng diaion) nằm trong xoang rỗng của diaion HP-20. Pha động sử dụng hệ dung môi rửa giải nước – MeOH (tăng dần nồng độ MeOH từ 0  100 %) có tác dụng phân tách các chất có độ phân cực khác nhau: Các nhóm hợp chất càng kém phân bố trong pha động thì càng bị lưu giữ lâu trong các xoang rỗng của diaion HP-20 và do đó sẽ ra khỏi cột sau cùng. Ngược lại, các chất càng phân bố nhiều trong pha động thì sẽ ra khỏi cột càng sớm.

Sắc ký cột silica gel có cơ chế phân tách các chất bằng hấp phụ. Silica gel có tính acid yếu phù hợp để phân tách monotropein có tính base yếu [62]. Silica là chất hấp phụ phân cực nên các cấu tử phân cực hơn trong hỗn hợp sẽ bị giữ lại mạnh hơn trong pha tĩnh và do đó sẽ đi ra khỏi cột sau cùng.

Sắc ký cột sephadex LH-20 phân tách hợp chất theo trọng lượng phân tử với những hợp chất có trọng lượng phân tử khoảng 100 – 4000 dalton, những hợp chất có trọng lượng phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trước, hơp chất có trọng lượng phân tử nhỏ

ra khỏi cột sau. Monotropein có trọng lượng phân tử nhỏ nhất trong các hợp chất iridoid, do đó, monotropein sẽ ra khỏi cột sau cùng.

Sử dụng phối hợp các loại cột như diaion HP-20, silica gel, cột pha đảo YMC- C18, cột sephadex LH20 đã phân lập được monotropein ra khỏi hỗn hợp các iridoid khác.

Luận án sử dụng phương pháp sắc ký lỏng bán điều chế để tinh chế sản phẩm thu được. Điều kiện sắc ký lỏng bán điều chế sử dụng cột sắc ký pha đảo C18 tương tự bản chất cột sắc ký trong phương pháp định tính, định lượng monotropein. Tuy nhiên, thành phần pha động không lựa chọn acid phosphoric 0,5 % mà lựa chọn amoni acetat do amoni acetat dễ được loại bỏ trong quá trình cô bay hơi dung dịch sau sắc ký. Sau khi tiến hành tinh chế sản phẩm MO7.2 bằng phương pháp sắc ký lỏng bán điều chế thu được nguyên liệu monotropein có độ tinh khiết cao (hàm lượng monotropein đạt 98,6 % - Bảng 3.3; hàm lượng tạp chất là 0,2 % - Bảng 3.16), đạt yêu cầu dùng làm nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn - Đây là điểm mới của luận án so với các nghiên cứu trước đó.

4.2.3. Phân lập, tinh chế nystose

Cao chiết nước chứa nystose, các hợp chất oligosacharid và các hợp chất tan trong nước khác. Việc sử dụng cột diaion HP-20 giúp phân tách nystose hỏi các hợp chất khác dựa vào độ phân cực của nystose so với các hợp chất khác. Than hoạt tính được sử dụng để phân tách các chất dựa trên cơ chế hấp phụ. Sử dụng các dung dịch rửa giải nước, EtOH 10 % và EtOH 20 % giúp cho việc kéo các chất được hấp phụ trong pha tĩnh ra pha động dựa trên tính tan của các hợp chất này. Sắc ký cột sephadex LH-20 phân tách nystose khỏi hỗn hợp oligosacharid dựa trên sự khác nhau của trọng lượng phân tử của nystose và các hợp chất khác.

Qui trình phân lập tinh chế nystose sử dụng phương pháp sắc ký cột diaion HP- 20, than hoạt tính và sephadex LH-20 là những phương pháp đơn giản, chi phí thấp, dễ thực hiện. Bên cạnh đó, phương pháp tinh chế bằng kết tinh lại cũng là một phương pháp phổ thông, thường được áp dụng trong tinh chế các hợp chất hữu cơ dựa trên đặc tính độ tan của chất. Kết quả của qui trình phân lập, tinh chế thu được hợp chất

nystose có độ tinh khiết cao (hàm lượng nystose là 97,59 % - Bảng 3.9) đạt yêu cầu làm nguyên liệu thiết lập chuẩn.

So với phương pháp phân lập, tinh chế nystose từ dược liệu rễ Ba kích đã được công bố (sử dụng phương pháp sắc ký cột silicagel và màng cellulose), sản phẩm nystose thu được có độ tinh khiết 95,2 % [60], phương pháp phân lập nystose của luận án đưa ra có độ tinh khiết cao hơn (97,59 %) và sử dụng các phương pháp sắc ký cột phổ thông, chi phí thấp.

4.2.4. Xác minh cấu trúc monotropein và nystose tinh chế được

Các chất sau khi chiết xuất, phân lập, tinh chế được xác định bộ dữ liệu nhận dạng cấu trúc, bao gồm: Nhiệt độ nóng chảy, phổ IR, phổ NMR (1H NMR, 13C NMR) và phổ khối là những kỹ thuật có độ chính xác, tin cậy cao.

Hợp chất monotropein: Hợp chất được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, trên phổ hồng ngoại có các đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl ở νmax 3388 cm-1, nhóm cacbonyl ở 1693 cm-1, nối đôi C=C ở 1643 cm-1. Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 389,0 [M -H]-. Kết hợp phổ 13C-NMR cho phép xác định công thức phân tử của chất là C16H22O11. Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton thấy xuất hiện tín hiệu của proton olefine ở vùng trường thấp ở δH 7,42 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-3); 6,24 (1H, dd, J = 2,5; 5,5 Hz, H-6); 5,64 (1H, dd, J = 2,0; 5,5 Hz, H-

7); tín hiệu của 1 proton anomeric δH 4,69 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), gợi ý sự có mặt của một phân tử đường, ngoài ra còn có tín hiệu của các proton aliphatic có δH nằm trong khoảng 3,89- 2,72 ppm. Trên phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT thấy xuất hiện tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon, trong đó có một nhóm cacbonyl ở vùng trường thấp δC 169,2 (C=O), 2 nhóm methylene sp3 và tín hiệu của 6 nguyên tử cacbon đặc trưng cho phân tử đường glucose ở δC 61,2 (C-6′); 70,1 (C-4′); 73,3 (C-2′); 76,6 (C- 3′); 76,9 (C-5′); 93,9 (C-1′). Kết hợp các dữ liệu phổ MS, và 1D-NMR cho phép khẳng định hợp chất phân tích là monotropein [40].

Hợp chất nystose: Hợp chất được phân lập có dạng tinh thể hình kim màu trắng, trên phổ hồng ngoại xuất hiện tín hiệu hấp thụ ở đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl ở νmax 3406 cm-1, phổ khối lượng có mảnh ion giả phân tử ở m/z = 689,3 [M

+ Na]+. Kết hợp phổ 13C-NMR cho phép xác định công thức phân tử của chất là

C24H42O21. Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu doublet của proton anomeric ở δH 5,40 (d, J = 3,5 Hz), và tín hiệu triplet của proton anome ở δH 4,06 (t, J = 8,5 Hz), 4,03 (t, J = 8,0 Hz), 4,00 (t, J = 8,5 Hz). Các tín hiệu proton này gợi ý hợp chất có 4 phân tử đường. Trên phổ DEPT thấy xuất hiện tín hiệu của 7 nhóm CH2, 14 nhóm CH và 3 nguyên tử cacbon không liên kết trực tiếp với hidro. Các số liệu phổ 13C-NMR và DEPT phù hợp với công thức cấu tạo của phân tử gồm 4 đơn vị đường trong đó có tín hiệu của 6 nguyên tử cacbon đặc trưng cho phân tử đường glucose ở δC 92,5; 71,2; 73,9; 69,3; 72,6; 60,2. Các số liệu phổ 13C- NMR còn lại đặc trưng cho 3 phân tử đường fructose. Dựa vào các số liệu phổ MS, NMR kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo có thể dự kiến chất phân tích là hợp chất nystose [81].

Kết quả kiểm tra nguyên liệu monotropein và nystose cho thấy sản phẩm tinh chế có hàm lượng cao, hàm lượng lần lượt là 98,58% và 98,01%.

4.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose

Thiết lập chất chuẩn đối chiếu cần phải tuân thủ các qui trình và hướng dẫn của ISO 17034, ISO GUIDE 35 và được thực hiện tại những phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP và ISO/IEC 17025. Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương là đơn vị được Bộ Y tế giao nhiệm vụ thiết lập chất chuẩn đối chiếu Dược điển Việt Nam và có năng lực (cơ sở vật chất, thiết bị, quy trình và nhân sự) đáp ứng đầy đủ theo quy định.

Phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô:

Theo qui định của Dược điển Việt Nam V – Phụ lục 9.6, để xác định mất khối lượng do làm khô thường được sử dụng bằng phương pháp sấy trong tủ sấy thường hoặc tủ sấy chân không. Tuy nhiên, lượng mẫu để thực hiện phương pháp sấy này yêu cầu một lượng khoảng 1 g, không phù hợp với nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Luận án đã sử dụng phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) theo hướng dẫn của Dược điển Mỹ (USP 40) [80] để giảm lượng mẫu sử dụng (khoảng 5 mg), có chương trình gia nhiệt tương đồng với phương pháp sấy thông thường: 25 ºC đến 105

ºC, tốc độ gia nhiệt 10˚C/phút, giữ ở 105ºC trong 180 phút. Kết quả xác định mất khối

lượng do làm khô của nguyên liệu monotropein và nystose lần lượt là 1,3 % (Bảng 3.15)

và 2,4 % (Bảng 3.27). Từ đó, luận án đưa ra giới hạn của chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô của chất chuẩn monotropein và nystose lần lượt là  2,0 % và  3,0 %.

Về chỉ tiêu tạp chất liên quan:

Áp dụng phương pháp định lượng monotropein để xác định tạp chất liên quan không định danh của nguyên liệu monotropein. Kết quả cho thấy, nguyên liệu monotropein có 1 tạp chất với hàm lượng là 0,2 %. Từ đó luận án đưa ra giới hạn tạp chất liên quan của chất chuẩn monotropein là: Tạp riêng lẻ  0,5 %; Tổng lượng tạp

 1,0 %.

Sử dụng phương pháp SKLM để xác định tạp chất liên quan của nguyên liệu nystose, kết quả nguyên liệu nystose không phát hiện tạp chất liên quan (so với vết đối chiếu có hàm lượng 1 %). Điều này chứng tỏ qui trình tinh chế nystose đã loại hoàn toàn được tạp chất, và luận án đưa ra giới hạn của chất chuẩn nystose là  1 %.

Yêu cầu hàm lượng chất chuẩn:

Yêu cầu chung về hàm lượng của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn là  95,0 % [24]. Áp dụng các phương pháp định lượng monotropein và nystose đã được thẩm định để xác định hàm lượng hoạt chất trong nguyên liệu, kết quả lần lượt là 98,06 % (Bảng 3.5) và 97,59% (Bảng 3.12). Căn cứ vào mức giới hạn của chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô, tạp chất liên quan đã xây dựng, cùng với kết quả định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn, luận án đưa ra mức giới hạn hàm lượng monotropein là  97,0 % và nystose là  96,5 %.

Đóng lọ chất chuẩn:

Chất chuẩn monotropein, nystose được đóng trong lọ thuỷ tinh trung tính, màu nâu với mục đích tránh ánh sáng và giảm tối đa tương tác giữa thuỷ tinh và chất chuẩn, đảm bảo cho chất chuẩn ổn định trong quá trình bảo quản. Lượng chất chuẩn trong mỗi lọ là 20 mg phù hợp cho các phép thử hoá lý trong 1 phép thử định lượng. Độ ẩm của buồng đóng chuẩn được kiểm soát, duy trì tại 2,0 % đảm bảo yêu cầu trong qui trình thiết lập chất chuẩn: Độ ẩm môi trường tương đương với hàm ẩm của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn [11].

Đánh giá độ đồng nhất lô:

Sau khi đóng lọ chất chuẩn, lấy ngẫu nhiên 10 lọ bán thành phẩm của mỗi chất chuẩn monotropein, nystose để xác định hàm lượng hoạt chất. Kết quả cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các lọ bán thành phẩm chất chuẩn monotropein và nystose lần lượt là 0,7 % (Bảng 3.19) và 1,0 % (Bảng 3.30), 2 giá trị này đều không vượt quá 1,0 % [24]. Như vậy, điều kiện đóng gói chất chuẩn ổn định, mẫu nguyên liệu đóng trong các lọ là đồng nhất.

Đánh giá liên phòng thí nghiệm và công bố hàm lượng chất chuẩn:

Sau khi đánh giá đồng nhất lô, luận án tiến hành đánh giá liên phòng thí nghiệm. Tập hợp kết quả định lượng trong mục đánh giá độ đồng nhất và đánh giá liên phòng thí nghiệm để đánh giá kết quả phân tích của 2 phòng thí nghiệm, luận án sử dụng student t-test cho hai tập hợp mẫu có phương sai không bằng nhau (T-test two sample assuming unequal variances trong phần mềm excel). Kết quả giá trị tTN của chất chuẩn monotropein và nystose lần lượt là 0,894 (Phụ lục 7) và 0,808 (Phụ lục 13) đều thấp hơn giá trị tLT (tLT = 1,761) với xác xuất 95 %. Như vậy, kết quả phân tích của các phòng thí nghiệm khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Hàm lượng chất chuẩn công bố là giá trị trung bình hàm lượng của 2 phòng thí nghiệm.

Nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn

Chất chuẩn sau khi thiết lập được bảo quản trong tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 2 oC – 8 oC. Luận án nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn thiết lập được dựa trên 2 chỉ tiêu là hàm lượng chất chuẩn (định lượng) và giới hạn tạp chất liên quan. Theo qui định của ISO Guide 35, chất chuẩn được đánh giá là ổn định khi:

- Phép thử định lượng: Hàm lượng chất chuẩn không sai khác quá 1,0 % so với hàm lượng chuẩn công bố; Giá trị (%) RSD của hàm lượng mẫu thử không được vượt quá 1,0 %.

- Phép thử xác định tạp chất: Hàm lượng tạp chất phải đạt theo yêu cầu của Tiêu chuẩn chất lượng.

Kết quả định lượng chất chuẩn sau thời gian 6 tháng và 1 năm đối với monotropein lần lượt là 98,53 % và 98,51 % (Bảng 3.26); đối với nystose lần lượt là và 97,98 % và 97,90 % (Bảng 3.35). Các giá trị này đều sai khác không quá 1,0 % so với hàm lượng chất chuẩn đã công bố (monotropein: 98,58 %, nystose: 98,01 %). Kết

quả xác định tạp chất liên quan của 2 chất chuẩn đều đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn chất lượng. Như vậy, chất chuẩn monotropein và nystose ổn định chất lượng trong quá trình bảo quản sau 1 năm.

Thiết lập chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu có vai trò hết sức quan trọng trong công tác tiêu chuẩn hoá dược liệu, cũng như công tác kiểm tra, giám chất lượng dược liệu trên thị trường của ngành kiểm nghiệm thuốc. Luận án đã lần đầu tiên thiết lập được 2 chất chuẩn Dược điển Việt Nam monotropein và nystose phân lập từ dược liệu rễ Ba kích có độ tinh khiết cao (hàm lượng hoạt chất tính theo nguyên trạng lần lượt là 98,58 % C16H22O11 và 98,01 % C24H42O21). Luận án đã thiết lập được 56 lọ chất chuẩn monotropein (Bảng 3.18) và 55 lọ chất chuẩn nystose (Bảng 3.29), khối lượng chuẩn trong mỗi lọ là 20 mg. Qui trình thiết lập chất chuẩn tuân thủ theo đúng qui định của ISO Guide 35 và qui trình thiết lập chất chuẩn Dược điển Việt Nam của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

* Định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích

Áp dụng phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích đã được thẩm định, sử dụng chất chuẩn DĐVN monotropein (SKS: 0119.C005.01) và nystose (SKS: 0119.C006.01) để định tính, định lượng monotropein và nystose trong 6 mẫu dược liệu tại Bảng 2.1. Kết quả định tính cho thấy: Mẫu BK2 và BK6 không chứa monotropein và nystose. Các mẫu còn lại (BK1, BK3, BK4 và BK5), hàm lượng (%) monotropein và nystose (tính theo dược liệu khô kiệt) lần lượt là 1,0 % - 3,1 % (Bảng 3.36) và 5,2 % - 6,1 % (Bảng 3.37).

4.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN

Qui trình tiến hành định danh dược liệu bao gồm các bước sau [37]:

- Lấy mẫu và xử lý mẫu

- Chiết tách ADN

- Nhân bản đoạn gen sử dụng kỹ thuật PCR

- Giải trình tự gen

- Phân tích kết quả