Nhân Bản Đoạn Gen, Giải Trình Tự Gen Và Định Danh Ba Kích

4.4.1.1. Chiết tách ADN toàn phần từ rễ Ba kích

* Lấy mẫu và xử lý mẫu

Tại Việt Nam, Ba kích phân bố ở một số tỉnh ở phía Bắc (Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Giang …), một số tỉnh miền Trung (Quảng Nam, Kon Tum …). Trên thị trường dược liệu, Ba kích được cung cấp dưới hai hình thức là thu hái tự nhiên và nuôi trồng tại các vùng trồng dược liệu. Trong khuôn khổ của luận án, đề tài tiến hành nghiên cứu trên 6 mẫu dược liệu rễ Ba kích bao gồm cả những mẫu tại các vùng trồng dược liệu (Quảng Ninh – BK4, Bắc Giang – BK1, Quảng Nam – BK5) và những mẫu thu hái tự nhiên (Hà Giang – BK2, BK6 và Quảng Ninh – BK3) tại một số tỉnh miền Bắc và miền Trung. Mặc dù số lượng mẫu chưa đủ lớn, chưa bao phủ tất cả các tỉnh có Ba kích nhưng trên một khía cạnh khác có thể đại diện cho khu vực có Ba kích hiện nay.

* Chiết tách ADN tổng số

ADN của tế bào thực vật ở dạng mạch thẳng nằm phần lớn trong nhân, một số ít nằm trong các bào quan khác như ty thể, lạp thể và có dạng vòng. Để tách chiết được ADN trong tế bào thực vật phải phá vỡ được vách tế bào, màng tế bào, màng nhân. Vách tế bào này cũng làm cho quá trình phá vỡ tế bào để chiết tách ADN thực vật khác và khó hơn so với các tế bào khác. Thông thường đối tượng của phương pháp phân tích chỉ ADN là mẫu lá tươi, mô non do có ưu điểm là có đầy đủ các thông tin di truyền và quá trình xử lý mẫu dễ dàng, trong khi còn việc xử lý mẫu rễ dược liệu khó xử lý do chứa nhiều protein, glucid hoặc lipid và khi chiết xuất phải tốn công loại bỏ tạp chất này. Tuy nhiên, vì đối tượng nghiên cứu của luận án là rễ dược liệu rễ Ba kích nên chúng tôi đã chủ ý lấy mẫu rễ là bộ phận dùng của dược liệu này, đây là một điểm mới của luận án.

Để phá vỡ vách tế bào, có một số phương pháp xử lý mẫu là nghiền mẫu bằng chày cối ở nhiệt độ thường, nghiền mẫu đã làm lạnh ở - 80 oC, và dùng máy xay. Với cách nghiền mẫu ở nhiệt độ thường, do mẫu có nhiều chất xơ, dai làm cho thời gian nghiền lâu, khó, dẫn đến các enzym nội sinh có thể làm hỏng ADN trong mẫu. Với phương pháp dùng máy xay cũng có nhược điểm tương tự, bên cạnh đó máy xay chỉ cắt nên phá vỡ vách của một số ít tế bào. Phương pháp nghiền bằng cối chày mẫu đã làm lạnh ở - 80 oC là tối ưu nhất. Do khi ở nhiệt độ - 80 oC, vách tế bào rất dễ vỡ nên

thời gian tiến hành ngắn, hạn chế ảnh hưởng của enzym nội sinh lên chất lượng ADN. Có nhiều cách làm lạnh mẫu ở nhiệt độ - 80 oC như sử dụng khí nitơ lỏng, để trong tủ lạnh âm sâu - 80 oC... Tận dụng điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, luận án đã sử dụng phương án để mẫu trong tủ lạnh âm sâu - 80 oC để tiết kiệm chi phí.

Hiện nay, quá trình chiết tách ADN thường sử dụng một số bộ kit chiết tách có sẵn của một số công ty chuyên nghiên cứu và cung cấp hoá chất cho lĩnh vực sinh học phân tử [37]. Với các bộ kit chiết tách ADN này, các công ty đã nghiên cứu và tối ưu hoá thành phần hoá chất, dung môi, quy trình xử lý mẫu để cho kết quả chiết tách ADN tốt nhất. Qua tham khảo, luận án lựa chọn bộ kit tách chiết ADN của hãng Qiagen là DNeasy mini plant kit.

Để kiểm tra kết quả chiết tách ADN có tinh sạch đảm bảo cho việc khuếch đại gen có 2 phương pháp là phương pháp điện di và đo mật độ quang:

- Phương pháp điện di: Phương pháp này chỉ phù hợp với những mẫu mà nồng độ ADN tách chiết tương đối lớn thì băng nhận được trên điện di mới rõ, quan sát được bằng mắt thường và hình ảnh chụp được rõ. Với những mẫu mà nồng độ ADN tách chiết thu được thấp, vạch không rõ, khó chụp ảnh hoặc không thể quan sát bằng mắt thường không có vạch nếu chỉ kiểm tra bằng phương pháp điện di rất dễ bỏ mất sản phẩm. Kết quả tách chiết ADN bằng phương pháp điện di cho thấy mẫu BK2 và BK6 cho vạch ADN thu được rõ, các mẫu còn lại đều quan sát được vạch nhưng mờ hơn mặc dù đã thay đổi nhiều cách xử lý mẫu (Hình 3.16). Điều này chứng tỏ, kết quả chiết tách ADN phụ thuộc và bản chất của mẫu phân tích.

Có thể bạn quan tâm!

• Kết Quả So Sánh Độ Tương Đồng Và Độ Phủ Của Các Mẫu Ba Kích So Với
• Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Monotropein Trong Nguyên Liệu Và Dược Liệu Rễ Ba Kích
• Thẩm Định Phương Pháp Định Tính Nystose Trong Dược Liệu Bằng Tlc
• Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích Radix Morindae officinalis của Việt Nam - 18
• Sắc Ký Đồ Đại Diện Của Phương Pháp Định Tính,
• Kết Quả Chồng Phổ Và Đánh Giá Độ Tinh Khiết Pic Monotropein

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

- Phương pháp đo mật độ quang: ADN hấp thụ mạnh nhất tại bước sóng 260 nm, protein hấp thụ mạnh nhất tại bước sóng 280 nm, một số thành phần hấp thụ mạnh ở bước sóng 230 nm như carbohydrat, phenol. Để đánh giá độ tinh sạch của dịch chiết ADN thường sử dụng chỉ số OD260/OD280 và OD260/OD230. Dịch chiết ADN được gọi là tinh sạch khi 2 chỉ số trên đều lớn hơn 1,8 [46]. Kết quả đo mật độ quang của 6 mẫu Ba kích tại Bảng 3.38 cho thấy chỉ số OD260/OD230 trong khoảng 1,88 – 2,63 và chỉ số OD260/OD280 trong khoảng 1,81 – 2,21 đều lớn hơn 1,8 (Bảng 3.38). Như vậy, quy trình chiết tách ADN đạt yêu cầu để tiến hành bước tiếp theo là khuếch đại gen.

- Kết quả định lượng nồng độ ADN của 6 mẫu Ba kích (Bảng 3.38) cho thấy 2 mẫu BK2, BK6 có nồng độ ADN gấp khoảng 2 lần so với nồng độ ADN của các mẫu còn lại (BK1, BK3, BK4 và BK4). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả điện di (Hình 3.16) là các vạch của 2 mẫu BK2, BK6 đậm hơn vạch của 4 mẫu còn lại.

4.4.1.2. Nhân bản đoạn gen, giải trình tự gen và định danh Ba kích

Để có thể biết được một trình tự gen của một đoạn ADN đích, cần phải nhân bản trình tự đó bằng phản ứng khuếch đại gen (polymerase chain reaction - PCR). PCR là một phương pháp tạo ra nhiều bản sao của một đoạn ADN cụ thể một cách nhanh chóng và chính xác.

Thành phần tham gia phản ứng:

- Dung dịch 10mmM dNTPs được sử dụng có chứa dATP, dCTP, dGTP và dTTP – là nguyên liệu để tổng hợp các nucleotid có độ tinh khiết cao, không chứa các thành phần ảnh hưởng đến phản ứng PCR.

- Phire Hot Start II DNA polymerase: Là một loại enzym chịu nhiệt giúp cho sự tổng hợp sợi ADN mới bằng cách bổ sung các nucleotid mới vào trình tự đích. So với Taq DNA polymerase, Phire Hot Start II DNA polymerase có ưu điểm hơn là giảm thời gian phản ứng và tăng hiệu suất bắt cặp mồi.

- Buffer Phire 5x có nồng độ MgCl2 là 7,5 mM và nồng độ cuối trong phản ứng khoảng 1,5 mM. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzym Taq polymerase, làm tăng Tm của ADN mạch kép.

- Việc lựa chọn mồi chung (universal primer) là rất quan trọng trong kỹ thuật nhân bản và giải trình tự gen. Các mồi chung được lựa chọn dựa trên tiêu chí có độ lặp lại tốt, có khả năng khuếch đại cho nhiều loài. Qua tham khảo tài liệu, luận án lựa chọn mồi chung cho các trình tự ITS, matK, rbcL, trnH-psbA tại Bảng 2.6. Trong những cặp mồi đã chọn lựa, chỉ có cặp mồi ITS1-ITS4 không cho kết quả lặp lại (3 lần thử nghiệm) thành công trên đoạn ITS nên không được lựa chọn và thay bằng mồi ITS P5-U4 cũng đặc hiệu trên đoạn này. Các cặp mồi được chọn khác đều có tỷ lệ khuếch đại thành công cao (100 %) nên đều được chọn.

- Qua tham khảo tài liệu, luận án đã lựa chọn chương trình PCR cho các đoạn mồi tại Bảng 2.7, Bảng 2.8, Bảng 2.9, Bảng 2.10 và Bảng 2.11. Cặp mồi ITS1-ITS4

không cho kết quả lặp lại thành công trên đoạn ITS (3 lần thử nghiệm) nên sẽ không được lựa chọn để nghiên cứu tiếp. Kết quả khuếch đại các đoạn gen trong cho thấy, kích thước các đoạn gen sau khi nhân bản của gen ITS và rbcL khoảng 700 bp (Hình 3.17, Hình 3.18), trnH- psbA khoảng 500 bp và matK khoảng 1000 bp (Hình 3.18). Kích thước của các đoạn gen này phù hợp cho quá trình giải trình tự gen.

- Công cụ BLAST Search hiện nay được sử dụng rộng rãi để định danh các loài thực vật nói chung và dược liệu nói riêng [37]. Mức độ tương đồng của các trình tự nghiên cứu với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gen của NCBI được thể hiện qua 2 thông số là tỷ lệ bao phủ (%) và tỷ lệ tương đồng (%). Khi 2 chỉ số này càng gần 100% thì trình tự của loài nghiên cứu được đánh giá là tương đồng với loài có sẵn trên ngân hàng gen.

Kết quả giải trình tự gen và tra cứu trên NCBI bằng công cụ BLAST search các trình tự gen ITS, matK, rbcL và trnH-pbsA tại các Bảng 3.39, Bảng 3.40, Bảng 3.41 và Bảng 3.42 cho thấy, 4 mẫu BK1, BK3, BK4 và BK5 là Morinda officinalis với hệ số tương đồng và bao phủ cao, còn mẫu BK2 và BK6 không phải là Morinda officinalis. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả kiểm tra sơ bộ đặc điểm hình thái của 6 mẫu Ba kích: Mặt cắt rễ của 4 mẫu BK1, BK3, BK4 và BK5 có phần thịt dày màu tím xám hoặc màu hồng nhạt, giữa là lõi gỗ nhỏ màu vàng nâu, trong khi mặt cắt rễ mẫu BK2 có phần vỏ và thịt rất mỏng, giữa là lõi gỗ màu trắng xám chiếm phần lớn kích thước đường kính, còn mặt cắt rễ mẫu BK6 có phần vỏ và thịt mỏng, phần lõi gỗ màu nâu xám chiếm phần lớn. Kết quả định danh 6 mẫu dược liệu cũng phù hợp với kết quả định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu, trong đó mẫu BK2 và BK6 không chứa monotropein và nystose.

Số liệu Bảng 3.43 cho thấy, trình tự vùng gen ITS của cả 4 mẫu Ba kích khá tương đồng và trùng khớp với gen ITS của M. officinalis AY551330với hệ số tương đồng từ 97,3 - 99,4 %, hệ số bao phủ  98 %; Trình tự trên gen matK của cả 4 mẫu Ba kích tương đồng và trùng khớp với gen matK của M. officinalis KR869730thể hiện qua hệ số tương đồng cao nhất (từ 99,3 – 100,0 %) và hệ số bao phủ  99 %; 2 trình tự còn lại rbcL và trnH-psbA cho hệ số tương đồng và bao phủ dao động lớn hơn, trong đó hệ số tương đồng của trình tự rbcL và trnH-psbA lần lượt là 97,7 - 99,8

% và 93,8 - 99,7 %, hệ số bao phủ của trình tự rbcL và trnH-psbA lần lượt là 85 –

100 % và 93 – 99 %.

4.4.1.3. Phân tích trình tự gen

Theo Taberlet P. và cộng sự [77], hệ thống mã vạch ADN lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:

- Đoạn ADN chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng

phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài.

- Hệ thống định danh bằng ADN phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng ADN có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau.

- Đoạn ADN chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ...).

- Có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ

bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự ADN.

Tại Việt Nam, một số tác giả đã chiết tách, giải trình tự ADN trên 1 trình tự ITS của Ba kích ở phía bắc Việt Nam [7],[9], chưa đủ điều kiện làm chỉ thị ADN cho dược liệu rễ Ba kích của Việt Nam. Để tìm ra những trình tự có đủ điều kiện là chỉ thị DNA của dược liệu rễ Ba kích, luận án đã khảo sát trên 4 trình tự gen ITS, matK, rbcL, trnH-psbA – đây là một điểm mới của luận án.

- Trong 4 trình tự ADN được chọn để nghiên cứu, các trình tự ITS và matK là ổn định nhất ở mức độ loài, nên là chọn lựa tốt để làm chỉ thị ADN cho Morinda officinalis. 2 trình tự này nằm ở 2 vị trí khác nhau: ITS trong nhân, matK trong chloroplast nên phù hợp để bổ sung cho nhau trong tình huống mẫu có khả năng bị biến đổi ít nhiều do chế biến.

- Trình tự trnH-psbA có sự biến động mạnh trong loài Morinda officinalis. Mặc dù rất nhiều tác giả đề cử làm ứng viên chỉ thị ADN cho dược liệu, nhưng trong trường hợp này, không nên dùng làm chỉ thị ADN để định danh để phân biệt ở mức độ loài. Tuy nhiên, có thể sử dụng trình tự này để nghiên cứu đa dạng sinh học, đặc biệt là các biến đổi vùng địa lý.

Như vậy, trình tự ITS và matK là 2 vùng gen đặc trưng có thể dùng để định danh

dược liệu rễ Ba kích (Morinda officinalis How) tại Việt Nam.

4.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính, định lượng

4.5.1. Bổ sung chỉ tiêu định tính

4.5.1.1. Định danh dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp chỉ thị ADN

Luận án đã tiến hành khảo sát và lựa chọn được trình tự ITS và matK là chỉ thị sinh học cho dược liệu rễ Ba kích. Để áp dụng phương pháp định danh dược liệu bằng chỉ thị ADN trên trình tự ITS và matK, cần đánh giá phương pháp dựa trên các nội dung sau:

- Đánh giá sự ảnh hưởng của các yếu tố:

+ Dịch chiết ADN toàn phần (lượng mẫu, độ tinh sạch của dịch chiết) [37]: Luận án đã sử dụng kit tách chiết DNeasy mini plant kit (Quiagen) để chiết tách ADN toàn phần từ 6 mẫu dược liệu rễ Ba kích, kết quả cho thấy dịch chiết ADN là tinh sạch (chỉ số chỉ số OD260/OD280 và OD260/OD230 đều lớn hơn 1,8), và nồng độ ADN từ 1,96 – 4,78 ng/ml (Bảng 3.38) phù hợp cho khuếch đại gen.

+ Điều kiện triển khai chương trình PCR (mồi chung, nhiệt độ và thời gian của các bước chương trình PCR) [37]: Luận án đã lựa chọn được các điều kiện của chương trình PCR cho trình tự ITS và matK, kết quả khuếch đại 2 trình tự này là lặp lại sau 3 lần thử nghiệm, đồng thời, kích thước của các trình tự sau khuếch đại bằng chương trình PCR phù hợp cho quá trình giải trình tự gen.

- Đánh giá độ phù hợp của phương pháp: Tiến hành trên tối thiểu 20 mẫu dược liệu rễ Ba kích chuẩn, từ đó xác định được các biến thể của trình tự trong loài để đánh giá sự phù hợp của phương pháp [37]. Luận án đã tiến hành phân tích các trình tự ITS, matK, trên 4 mẫu dược liệu được định danh là Ba kích. Kết quả cho thấy 2 trình tự này có ít biến thể trong cùng loài, phù hợp làm chỉ thị ADN để định danh dược liệu rễ Ba kích. Tuy nhiên, cỡ mẫu của thực hiện còn nhỏ (4 mẫu) so với lượng mẫu yêu cầu tối thiểu 20 mẫu dược liệu [37]. Đây là một điểm hạn chế của luận án do hạn chế về thời gian thực hiện. Để đánh giá chính xác về tính phù hợp của phương pháp, cần tiến hành thực nghiệm trên tối thiểu 20 mẫu dược liệu rễ Ba kích của Việt Nam,

trong đó lấy mẫu ở nhiều địa phương, nhiều thời điểm trong năm, cùng một loài Ba kích có thể lấy mẫu ở nhiều độ tuổi khác nhau.

Kết quả định danh dược liệu bằng chỉ thị ADN phù hợp với kết quả kiểm tra sơ bộ hình thái dươc liệu, kết quả định tính, định lượng 2 “marker” của dược liệu rễ Ba kích là monotropein và nystose: 2 mẫu BK2 và BK6 được định danh bằng chỉ thị ADN không phải là M. officinalis và không chứa monotropein, nystose.

Để phương pháp này có tính khả thi và áp dụng rộng rãi trên toàn quốc, các đơn vị kiểm nghiệm cần trang bị thiết bị PCR, thiết bị giải trình tự gen. Bên cạnh đó, con người cần được đào tạo về phương pháp phân tích chỉ thị ADN và các kiến thức liên quan. Với tình hình hiện tại, hệ thống kiểm nghiệm nhà nước cũng như các phòng kiểm nghiệm trong các doanh nghiệp chưa sẵn sàng các điều kiện cho các yêu cầu này. Đồng thời, DDVN V chưa có chuyên luận chung về phương pháp định danh dược liệu bằng chỉ thị ADN. Vì những lý do trên, luận án chưa đề xuất bổ sung chỉ tiêu này vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích mà chỉ đề xuất đây là một phương pháp bổ sung để kiểm tra tính đúng của dược liệu rễ Ba kích.

4.5.1.2. Định tính monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích

Hiện tại, Dược điển Việt Nam V chưa có phép thử định tính 2 “marker” monotopein và nystose, cần phải bổ sung chỉ tiêu định tính 2 “marker” này vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích.

Đối với phép thử định tính monotropein, luận án đã đưa ra phương pháp định tính monotropein bằng HPLC-DAD thông qua phép thử định lượng. Phương pháp này đã được thẩm định về độ đặc hiệu và phù hợp trong việc xác định sự có mặt hay không monotropein trong dược liệu rễ Ba kích.

Đối với phép thử định tính nystose, luận án đưa ra 2 phương pháp: Phương pháp định tính nystose bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và phương pháp HPLC-ELSD thông qua phép thử định lượng. Cả 2 phương pháp đã được thẩm định về độ đặc hiệu và phù hợp để định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích. Phương pháp định tính nystose là một phương pháp đơn giản, thông dụng và tất cả các phòng thí nghiệm đều có thể triển khai khi có chất chuẩn nystose – Đây là phương pháp khả thi khi được bổ sung vào Dược điển Việt Nam.

4.5.2. Bổ sung chỉ tiêu định lượng

Để đánh giá chất lượng dược liệu rễ Ba kích, cần kiểm soát hàm lượng các

“marker” có trong dược liệu rễ Ba kích, đó là monotropein và nystose.

Về phương pháp định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích đã được thẩm định theo yêu cầu của ICH Q2(R1) [52]. Kết quả thẩm định cho thấy, phương pháp định lượng monotropein (bằng HPLC-DAD) và nystose (bằng HPLC- ELSD) là chính xác và đảm bảo yêu cầu để định lượng 2 hoạt chất này trong dược liệu rễ Ba kích.

Về giới hạn hàm lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích:

- Kết quả định lượng monotropein (tính theo dược liệu khô kiệt) trong 4 mẫu dược liệu rễ Ba kích thu hái tại Việt Nam đã khảo sát cho thấy hàm lượng monotropein từ 1,0 % đến 3,1 %, trong đó mẫu BK1 có hàm lượng monotropein thấp nhất, và mẫu BK3 có hàm lượng monotropein cao nhất. Luận án tiến hành định lượng tiếp trên 16 dược liệu rễ Ba kích được thu hái tại một số tỉnh tại Việt Nam, kết quả cho thấy hàm lượng (%) monotropein (tính theo dược liệu khô kiệt) thấp nhất là 0,2

% (Phụ lục 19) - cao hơn hàm lượng (%) monotropein trong dược liệu rễ Ba kích tại Nhật Bản là 0,042 % [91]. Căn cứ kết quả định lượng thực tế, mức giới hạn định lượng monotropein bước đầu được đưa ra là “ 0,2 %”.

- Kết quả định lượng nystose (tính theo dược liệu khô kiệt) trong 4 mẫu dược liệu rễ Ba kích đã khảo sát cho thấy hàm lượng nystose từ 5,3 % đến 6,9 %, trong đó, mẫu BK1 có hàm lượng nystose thấp nhất, và mẫu BK3, BK5 có hàm lượng nystose cao nhất. So sánh với mức giới hạn hàm lượng nystose quy định trong Dược điển Trung Quốc là  2,0 % [37]; Bộ tiêu chuẩn chất lượng dược liệu của Hồng Kông là

 2,3 % [47], hàm lượng các mẫu Ba kích đã khảo sát có hàm lượng cao hơn 2 lần mức giới hạn này. Tuy nhiên, nguồn cung cấp dược liệu rễ Ba kích tại Việt Nam bao gồm cả nguồn nhập khẩu và nguồn cấy trồng, thu hái trong nước. Mức giới hạn chấp nhận hàm lượng nystose nên bao phủ được tất cả các đối tượng, cũng như hoà hợp với các Dược điển trên thế giới, do vậy, luận án đặt mức giới hạn định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích là “ 2,0 %”.