Kết Quả Định Lượng Nghiên Cứu Độ Ổn Định Chất Chuẩn Nystose (1 Năm)

Stt

Lượng cân (mg)	Diện tích pic (mV.s)	Ln(Diện tích pic)	Hàm lượng (%)
4	10,85	149637	11,9160	98,32
5	11,11	155231	11,9527	98,34
6	10,29	135559	11,8172	97,21
Trung bình				97,98
RSD (%)				0,43

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

* Thời gian 1 năm

- Phương trình hồi qui tuyến tính: Y = 1,34 X + 4,79

Kết quả định lượng trong nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose sau 1 năm được trình bày tại Bảng 3.34.

Bảng 3.34. Kết quả định lượng nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose (1 năm)

Stt

Lượng cân (mg)	Diện tích pic (mV.s)	Ln(Diện tích pic)	Hàm lượng (%)
1	11,03	419176	12,9460	98,58
2	10,72	399159	12,8971	97,80
3	10,13	367756	12,8152	97,37
4	11,24	425013	12,9599	97,74
5	10,99	416082	12,9386	98,40
6	10,29	376232	12,8380	97,50
Trung bình				97,90
RSD				0,50

b. Tạp chất liên quan

Kết quả xác định tạp chất liên quan trong nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose sau thời gian 6 tháng và 1 năm được trình bày trong Hình 3.15.

a. 6 tháng b. 1 năm

(1): Dung dịch chuẩn (2): Dung dịch đối chiếu 1 (3): Dung dịch thử 1

(4): Dung dịch đối chiếu 2 (5): Dung dịch thử 2

Hình 3.15. Kết quả thử tạp chất liên quan nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose

Kết quả tại Hình 3.14 cho thấy, dung dịch thử không xuất hiện vết phụ nào ngoại trừ vết chính tương ứng với vết nystose.

Tổng hợp kết quả định lượng và tạp chất liên quan của chất chuẩn nystose (0119.C006.01) sau 1 năm nghiên cứu độ ổn định được trình bày tại Bảng 3.35.

Bảng 3.35. Tổng hợp kết quả nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose sau 1 năm

Chỉ tiêu

0 Tháng	6 tháng	1 năm	Yêu cầu
1. Định lượng
- Hàm lượng (%) nystose	98,01	97,98	97,90	 97,0
- Sai khác (%)	-	0,03	0,11	 1,0
2. Tạp chất liên quan	Không phát hiện	Không phát hiện	Không phát hiện	 1,0

Kết quả theo dõi độ ổn định chất chuẩn nystose (SKS: 0119.C006.01) sau 1 năm

cho thấy:

- Hàm lượng nystose sau 1 năm giảm không quá 1,0 % so với hàm lượng chuẩn công bố

- Không phát hiện tạp chất liên quan.

Như vậy, chất chuẩn nystose, SKS: 0119.C006.01 ổn định chất lượng trong quá trình bảo quản 1 năm.

3.3.3. Định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích

3.3.3.1. Định tính, định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích

- Tiến hành theo phương pháp tại Mục 2.3.1.1.

- Chất chuẩn sử dụng: Chất chuẩn DĐVN monotropein, số kiểm soát

0119.C005.01, hàm lượng: 98,58 % (nguyên trạng).

- Lượng cân chất chuẩn monotropein: 10,41 mg. Diện tích pic monotropein trong dung dịch chuẩn: 1791179 mAU.s

Kết quả định lượng monotropein trong 6 mẫu dược liệu (BK1, BK2, BK3, BK4, BK5 và BK6) tính theo dược liệu khô kiệt được trình bày trong Bảng 3.36.

Bảng 3.36. Kết quả định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích

Stt

Lượng cân (g)	Diện tích pic (mAU.s)	Hàm lượng (%) tính theo dược liệu khô kiệt	Trung bình (%)	RSD (%)
I	Mẫu BK1 (Độ ẩm: 9,14 %)
1	0,6025	395836	1,0	1,0	0,7
2	0,6064	397841	1,0
3	0,6084	394355	1,0
II	Mẫu BK2 (Độ ẩm: 9,23%)
1	0,6092	0	0,0	0,0	-
2	0,5904	0	0,0
3	0,5993	0	0,0
III	Mẫu BK3 (Độ ẩm: 11,52 %)
1	0,6048	1169307	3,1	3,1	0,5
2	0,6054	1171950	3,1
3	0,6045	1179185	3,2
IV	Mẫu BK4 (Độ ẩm: 9,74 %)
1	0,6045	493627	1,3	1,3	0,6
2	0,6088	491565	1,3
3	0,6045	491992	1,3
V	Mẫu BK5 (Độ ẩm: 10,49 %)
1	0,6089	799301	2,1	2,1	0,7
2	0,6011	799392	2,1
3	0,6008	797788	2,1

Stt

Lượng cân (g)	Diện tích pic (mAU.s)	Hàm lượng (%) tính theo dược liệu khô kiệt	Trung bình (%)	RSD (%)
VI	Mẫu BK6 (Độ ẩm: 10,56 %)
1	0,5987	0	0,0	0,0	-
2	0,6023	0	0,0
3	0,6041	0	0,0

Mẫu BK2 và BK6 không phát hiện hoạt chất monotropein. Các mẫu còn lại,

Hàm lượng monotropein từ 1,0 % (mẫu BK1) đến 3,1 % (mẫu BK3).

3.3.3.2. Định tính, định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích

- Tiến hành theo phương pháp tại Mục 2.3.1.2.

- Chất chuẩn sử dụng: Chất chuẩn DĐVN nystose, SKS: 0119.C006.01, hàm

lượng: 98,01% (nguyên trạng).

- Lượng cân chất chuẩn nystose: 10,78 mg. Diện tích pic nystose trong dung dịch chuẩn: 358315 mV.s.

Kết quả định lượng 6 mẫu dược liệu rễ Ba kích được trình bày trong Bảng 3.37.

Bảng 3.37. Kết quả định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích.

Stt

Lượng cân (g)	Diện tích pic (mV.s)	Ln(diện tích pic)	Hàm lượng (%) tính theo dược liệu khô kiệt	Trung bình (%)	RSD (%)
I	Mẫu BK1 (Độ ẩm: 9,14 %)
1	0,4902	413659	12,9328	5,2	5,2	0,2
2	0,5021	437679	12,9892	5,2
3	0,5088	450834	13,0189	5,2
II	Mẫu BK2 (Độ ẩm: 9,23%)
1	0,5035	0	-	-	-	-
2	0,5094	0	-	-
3	0,5012	0	-	-
III	Mẫu BK3 (Độ ẩm: 11,52 %)
1	0,5010	611334	13,3234	6,1	6,0	1,2
2	0,5011	603711	13,3109	6,0
3	0,5011	583261	13,2764	5,9
IV	Mẫu BK4 (Độ ẩm: 9,74 %)
1	0,5085	498767	13,1110	5,4	5,4	1,1
2	0,5106	486831	13,0957	5,3
3	0,4874	460993	13,0411	5,5
V	Mẫu BK5 (Độ ẩm: 10,49 %)

Stt

Lượng cân (g)	Diện tích pic (mV.s)	Ln(diện tích pic)	Hàm lượng (%) tính theo dược liệu khô kiệt	Trung bình (%)	RSD (%)
1	0,4982	608629	13,3190	6,1	6,1	0,8
2	0,4975	596851	13,2994	6,0
3	0,5107	651776	13.3875	6,1
VI	Mẫu BK6 (Độ ẩm: 10,56 %)
1	0,4904	0	-	-	-	-
2	0,5021	0	-	-
3	0,5019	0	-	-

Mẫu BK2 và BK6 không phát hiện hoạt chất nystose. Các mẫu còn lại, Hàm

lượng nystose từ 5,2 % (mẫu BK1) đến 6,1 % (mẫu BK5).

3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN

3.4.1. Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu

Tiến hành chiết tách ADN toàn phần theo phương pháp nêu tại Mục 2.3.4.1 thu

được các dịch chiết tách ADN.

Kiểm tra DNA tách chiết toàn phần theo bằng điện di trên gel và đo mật độ quang theo phương pháp tại mục Mục 2.3.4.1.

Kết quả đánh giá dịch DNA chiết tách bằng điện di trên gel thể hiện tại Hình

3.16.

Hình 3.16. Kết quả điện di tách chiết ADN toàn phần

Kiểm tra kết quả dịch tách chiết ADN toàn phần bằng phương pháp đo mật độ

quang được thể hiện tại Bảng 3.38.

Bảng 3.38. Kết quả đo mật độ quang của dịch tách chiết ADN toàn phần

Stt

Mẫu	OD230	OD260	OD280	OD260/OD230	OD260/OD280	Nồng độ (ng/ml)
1	BK1	0,022	0,057	0,028	2,591	2,036	2,577
2	BK2	0,043	0,108	0,056	2,512	1,929	4,777
3	BK3	0,016	0,042	0,019	2,625	2,211	1,958
4	BK4	0,025	0,047	0,026	1,880	1,807	1,984
5	BK5	0,022	0,049	0,027	2,227	1,815	2,110
6	BK6	0,047	0,107	0,056	2,277	1,911	4,714

Kết quả kiểm tra tách chiết ADN bằng phương pháp đo mật độ quang cho thấy kết quả phù hợp với kết quả điện di. Các mẫu BK2 và BK6 có nồng độ ADN là 4,7 ng/ml và gấp đôi các mẫu còn lại. Về độ tinh sạch, tỷ lệ OD260/OD230 và OD260/OD280 của 6 mẫu đều lớn hơn 1,8 cho thấy các mẫu là tinh sạch.

3.4.2. Nhân bản đoạn gen

Phương pháp khuếch đại gen tại Mục 2.3.4.2.

Kết quả khuếch đại đoạn gen ITS được thể hiện ở Hình 3.17.

(a) Trình tự ITS với mồi ITS P5- ITS U4 (b) Trình tự ITS với mồi ITS4-ITS1

Hình 3.17. Kết quả khuếch đại đoạn ITS với đoạn mồi ITS P5- ITS U4 và ITS4- ITS1

Kết quả khuếch đại các đoạn gen rbcL, trnH-psbA và matK trên chloroplast

được thể hiện ở Hình 3.18.

(a) Trình tự rcbL với mồi rcbLaF- rcbLaR

(b) Trình tự trnH-psbA với mồi trnH- psbA

Hình 3.18. Kết quả khuếch đại đoạn gen trên chloroplast

Cặp mồi ITS1-ITS4 không cho kết quả lặp lại thành công trên đoạn ITS (3 lần thử nghiệm) nên sẽ không được lựa chọn để nghiên cứu tiếp. Các cặp mồi được chọn khác đều có tỷ lệ khuếch đại thành công 100% nên đều được chọn.

3.4.3. Giải trình tự gen và định danh dược liệu

Phương pháp tiến hành theo Mục 2.3.4.3.

Kết quả giải trình tự gen, tra cứu trên NCBI bằng công cụ BLAST search các trình tự gen ITS, matK, rbcL và trnH-pbsA được thể hiện lần lượt tại Bảng 3.39, Bảng 3.40, Bảng 3.41 và Bảng 3.42.

Bảng 3.39. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự ITS

Mẫu

Kết quả BLAST search	Trình tự tương đồng	Tỷ lệ bao phủ (%)	Tương đồng (%)
BK1	Morinda officinalis	AY51330	98	99,07
BK2	Polygala tricholopha	KJ490658	44	99,00
BK3	Morinda officinalis	AY51330	99	99,38
BK4	Morinda officinalis	AY51330	98	99,42
BK5	Morinda officinalis	AY51330	98	97,27
BK6	Polygala tricholopha	KJ490658	41	96,00

Bảng 3.40. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự matK

Mẫu

Kết quả BLAST search	Trình tự tương đồng	Tỷ lệ bao phủ (%)	Tương đồng (%)
BK1	Morinda officinalis	KR869730	100	100,00
BK2	Polygala chamaebuxus var grandiflora	EU596517	99	94,87
BK3	Morinda officinalis	KR869730	100	100,00
BK4	Morinda officinalis	KR869730	100	99,66
BK5	Morinda officinalis	KR869730	99	99,33
BK6	Polygala chamaebuxus var grandiflora	EU596517	99	94,64

Bảng 3.41. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự rbcL

Mẫu

Kết quả BLAST search	Trình tự tương đồng	Tỷ lệ bao phủ (%)	Tương đồng (%)
BK1	Morinda officinalis	KR869730	89	99,62
BK2	Polygala chamaebuxus var grandiflora	AM234210	94	98,15
	Polygala arillata	AM234198	94	98,32
	Heterosamara tatarinomi	AM234208	94	98,21
BK3	Morinda officinalis	KR869730	90	99,81
BK4	Morinda officinalis	KR869730	85	97,70
BK5	Morinda officinalis	KR869730	100	98,19
BK6	Heterosamara tatarinomi	AM234208	96	98,24

Bảng 3.42. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự trnH-pbsA

Mẫu

Kết quả BLAST search	Trình tự tương đồng	Tỷ lệ bao phủ (%)	Tương đồng (%)
BK1	Morinda officinalis	KR869730	93	93,80
BK2	Polygala sphenoptera	KR735816	70	94,56
BK3	Morinda officinalis	KR869730	98	99,50
BK4	Morinda officinalis	KR869730	99	99,75
BK5	Morinda officinalis	KR869730	98	99,19
BK6	Polygala sphenoptera	KR735816	76	94,62

Kết quả giải trình tự và định danh trên đoạn gen ITS cho thấy chỉ có 4 trong 6 mẫu ban đầu (BK1, BK3, BK4 và BK5) là Morinda officinalis, 2 mẫu còn lại (BK2