và BK6) không phải là Morinda officinalis. Bên cạnh đó, kết quả giải trình tự 3 gen matK, rbcL và trnH-psbA cũng khẳng định lại BK2 và BK 6 không phải là Morinda officinalis. Tổng hợp kết quả so sánh mức độ bao phủ (Query cover) và tương đồng (Ident) của 4 mẫu BK1, BK3, BK4 và BK5 với đoạn ITS của Morinda officinalis AY551330 và các gen trên chloroplast (matK, trnH-psbA và rbcL) của Morinda officinalis KR869730 được trình bày tại Bảng 3.43.
Bảng 3.43. Kết quả so sánh độ tương đồng và độ phủ của các mẫu Ba kích so với
M. officinalis KR869730 và M. officinalis AY551330
ITS | matK | rbcL | trnH-psbA | |||||
Bao phủ (%) | Tương đồng (%) | Bao phủ (%) | Tương đồng (%) | Bao phủ (%) | Tương đồng (%) | Bao phủ (%) | Tương đồng (%) | |
BK1 | 98 | 99,07 | 100 | 100,00 | 89 | 99,62 | 93 | 93,80 |
BK3 | 99 | 99,38 | 100 | 100,00 | 90 | 99,81 | 98 | 99,50 |
BK4 | 98 | 99,42 | 100 | 99,66 | 85 | 97,70 | 99 | 99,75 |
BK5 | 98 | 97,27 | 99 | 99,33 | 100 | 98,19 | 98 | 99,19 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Sơ Đồ Phân Lập, Tinh Chế Nystose Từ Cao Chiết Nước -
Kết Quả Định Lượng Độ Ổn Định Chất Chuẩn Monotropein (6 Tháng) -
Kết Quả Định Lượng Nghiên Cứu Độ Ổn Định Chất Chuẩn Nystose (1 Năm) -
Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Monotropein Trong Nguyên Liệu Và Dược Liệu Rễ Ba Kích -
Thẩm Định Phương Pháp Định Tính Nystose Trong Dược Liệu Bằng Tlc -
Nhân Bản Đoạn Gen, Giải Trình Tự Gen Và Định Danh Ba Kích
Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.
3.4.4. Phân tích trình tự gen
3.4.4.1. Trình tự gen ITS
Tiến hành gióng hàng các trình tự gen ITS của 4 mẫu Ba kích (BK1, BK3, BK4 và BK5), kết quả được thể hiện tại Hình 3.19.
Hình 3.19. Kết quả gióng hàng trên trình tự ITS
Tiến hành tính khoảng cách di truyền dựa trên trình tự gen ITS của 4 mẫu Ba kích (BK1, BK3, BK4 và BK5), kết quả được thể hiện tại Bảng 3.44.
Bảng 3.44. Khoảng cách di truyền của các mẫu trên trình tự ITS
M. officinalis AY551330 | BK1 | BK3 | BK4 | BK5 | |
M. officinalis AY551330 | |||||
BK1 | 0,0125 | ||||
BK3 | 0,0078 | 0,0078 | |||
BK4 | 0,0116 | 0,0115 | 0,0057 | ||
BK5 | 0,0658 | 0,0317 | 0,0286 | 0,0254 |
Kết quả gióng hàng trình tự gen ITS cho thấy cả 4 mẫu đều có 1 vị trí sai lệch (133/520) so với M. officinalis AY551330. Ngoài ra, BK1 có thêm 2 vị trí sai lệch (519/520 và 520/520), BK3 có thêm 1 vị trí sai lệch (520/520), BK4 có thêm 4 vị trí sai lệch (1/520, 3/520 10/520 và 520/520) và BK 5 có thêm 11 vị trí sai lệch so với
M. officinalis AY551330. Khoảng cách loài tại Bảng 3.44 cũng cho thấy BK3 hoàn toàn trùng khớp với M. officinalis KR869730 trên gen ITS. Như vậy, nếu xét về đa dạng di truyền trên gen ITS, đây là 4 giống khác nhau của cùng loài.
3.4.4.2. Trình tự gen matK
Tiến hành gióng hàng các trình tự gen matK của 4 mẫu Ba kích (BK1, BK3, BK4 và BK5), kết quả được thể hiện tại Hình 3.20.
Hình 3.20. Kết quả gióng hàng trên trình tự matK
Tiến hành tính khoảng cách di truyền dựa trên trình tự gen matK của 4 mẫu Ba kích (BK1, BK3, BK4 và BK5), kết quả được thể hiện tại Bảng 3.45.
Bảng 3.45. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự matK
M. officinalis KR869730 | BK5 | BK4 | BK3 | BK1 | |
M. officinalis KR869730 | |||||
BK5 | 0,0023 | ||||
BK4 | 0,0035 | 0,0058 | |||
BK3 | 0,0023 | 0,0046 | 0,0058 | ||
BK1 | 0,0000 | 0,0023 | 0,0035 | 0,0023 |
Kết quả gióng hàng trình tự gen matK cho thấy mẫu BK1 hoàn toàn trùng khớp với M. officinalis KR869730. Trong khi đó, 3 mẫu còn lại đều có vị trí sai lệch với
M. officinalis KR869730: BK3 có 2 vị trí sai lệch (863/866 và 866/866), BK4 có 2 vị trí sai lệch (399/866 và 422/866), BK 5 có 1 vị trí sai lệch (81/866). Khoảng cách loài tại Bảng 3.45 cũng cho thấy BK1 hoàn toàn trùng khớp với M. officinalis KR869730 trên gen matK. Như vậy, khi đánh giá trên gen matK, có thể khẳng định lại 4 mẫu BK1, BK3, BK4 và BK5 là những giống khác nhau của cùng 1 loài.
3.4.4.3. Trình tự gen rbcL
Tiến hành gióng hàng các trình tự gen rbcL của 4 mẫu Ba kích (BK1, BK3, BK4 và BK5), kết quả được thể hiện tại Hình 3.21.
Hình 3.21. Kết quả gióng hàng trên trình tự rbcL
Tiến hành tính khoảng cách di truyền dựa trên trình tự gen rbcL của 4 mẫu Ba kích (BK1, BK3, BK4 và BK5), kết quả được thể hiện tại Bảng 3.46.
Bảng 3.46. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự rbcL
M. officinalis KR869730 | BK5 | BK4 | BK3 | BK1 | |
M. officinalis KR869730 | |||||
BK5 | 0,0145 | ||||
BK4 | 0,0376 | 0,0749 | |||
BK3 | 0,0019 | 0,0607 | 0,0703 | ||
BK1 | 0,0038 | 0,0562 | 0,0742 | 0,0071 |
Kết quả gióng hàng trên gen rbcL cho thấy so với Morinda officinalis KR869730, mẫu BK1 chỉ có 2/524 vị trí sai khác, mẫu BK3 có 1/524 vị trí sai khác, mẫu BK5 có 7/524 vị trí sai khác, đặc biệt mẫu BK4 có tới 17/524 vị trí sai khác. Kết quả gióng hàng này cũng phù hợp với khoảng cách di truyền so với Morinda officinalis KR869730, mẫu BK3 có khoảng cách gần nhất, rồi lần lượt đến mẫu BK1, mẫu BK5, và mẫu BK4 có khoảng cách di truyền xa nhất.
3.4.4.4. Trình tự gen trnH-psbA
Tiến hành gióng hàng các trình tự gen trnH-psbA của 4 mẫu Ba kích (BK1, BK3, BK4 và BK5), kết quả được thể hiện tại Hình 3.22.
Hình 3.22. Kết quả gióng hàng trên trình tự trnH-psbA
Tiến hành tính khoảng cách di truyền dựa trên trình tự gen trnH-psbA của 4 mẫu Ba kích (BK1, BK3, BK4 và BK5), kết quả được thể hiện tại Bảng 3.47.
Bảng 3.47. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự trnH-psbA
M. officinalis KR869730 | BK5 | BK4 | BK3 | BK1 | |
M. officinalis R869730 | |||||
BK5 | 0,0041 | ||||
BK4 | 1,3173 | 0,9738 | |||
BK3 | 0,0053 | 0,0122 | 1,3740 | ||
BK1 | 0,0058 | 0,0047 | 1,4444 | 0,0143 |
Kết quả gióng hàng trên gen trnH-psbA cho thấy so với M. officinalis KR869730 và các mẫu còn lại, mẫu BK4 gần như tách như khỏi nhóm (có 103/272 vị trí sai khác), các mẫu BK1, BK3 và BK5 không có vị trí sai khác với M. officinalis KR869730. Kết quả gióng hàng này cũng phù hợp với khoảng cách di truyền so với
M. officinalis KR869730, mẫu BK5 có khoảng cách gần nhất, rồi lần lượt đến mẫu BK3, mẫu BK1, và mẫu BK4 có khoảng cách di truyền xa nhất (1,3). Khoảng cách di truyền của BK4 so với các mẫu trong nhóm tương đối lớn ( 0,97).
3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng
3.5.1. Bổ sung các chỉ tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam.
Dựa trên phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu đã được thẩm định, kết quả khảo sát hàm lượng monotropein, nystose trong một số mẫu dược liệu rễ Ba kích tại Việt Nam, luận án dự kiến bổ sung một số chỉ tiêu vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của Dược điển Việt Nam và được tóm tắt tại Bảng 3.48.
Bảng 3.48. Tóm tắt các chỉ tiêu bổ sung vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của
Dược điển Việt Nam.
Chỉ tiêu | Yêu cầu | Phương pháp thử | |
1 | Định tính | ||
Monotropein | Sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic monotroepin trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn | Kết quả mục định lượng monotropein | |
Nystose | Dung dịch thử cho vết chính có vị trí (Rf) tương ứng với vết nystose cho bởi dung dịch chuẩn | Sắc ký lớp mỏng | |
Sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic nystose trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn | Kết quả mục định lượng nystose | ||
2 | Định lượng | ||
Monotropein | ≥ 0,2 % monotropein (C16H22O11), tính theo dược liệu khô kiệt | Phương pháp HPLC- DAD | |
Nystose | ≥ 2,0 % nystose (C24H42O21), tính theo dược liệu khô kiệt | Phương pháp HPLC- ELSD |
3.5.2. Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam VI
BA KÍCH (Rễ)
Radix Morindae officinalis
Dây ruột gà
Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Ba kích (Morinda officinalis How), họ Cà phê (Rubiaceae).
Mô tả
Rễ hình trụ tròn hay hơi dẹt, cong queo, dài 3 cm trở lên, đường kính 0,3 cm trở lên. Mặt ngoài màu nâu xám hoặc nâu nhạt, có nhiều vân dọc và ngang. Nhiều chỗ nứt ngang sâu tới lõi gỗ. Mặt cắt có phần thịt dày màu tím xám hoặc màu hồng nhạt, giữa là lõi gỗ nhỏ màu vàng nâu, vị hơi ngọt và hơi chát.
Vi phẫu
Mặt cắt dược liệu hình tròn, từ ngoài vào trong có: Lớp bần gồm 2 đến 3 hàng tế bào hình chữ nhật xếp thành vòng tròn đồng tâm và dãy xuyên tâm, trong lớp bần
thường có các tế bào chứa bó tinh thể calci oxalat hình kim, sát lớp bần có các tế bào mô cứng xếp liền nhau tạo thành vòng. Mô mềm vỏ dày, cấu tạo bởi những tế bào thành mỏng, xếp lộn xộn, các tế bào ở phần ngoài bị ép bẹp. Phía trong mô mềm là libe, gồm các tế bào nhỏ tạo thành vòng liên tục. Rải rác trong mô mềm và libe có các bó tinh thể calci oxalat hình kim. Gỗ gồm các mạch gỗ lớn xếp thành bó, các bó kết hợp với nhau tạo thành lõi hình sao 5, 6 cạnh. Trong mô gỗ có những đám tế bào không hóa gỗ.
Bột
Bột có màu nâu nhạt, vị hơi chát, mùi thơm dịu. Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh bần gồm các tế bào hình chữ nhật, mảnh mô mềm cấu tạo bởi các tế bào hình nhiều cạnh thành mỏng, một số tế bào chứa bó tinh thể calci oxalat hình kim. Sợi gỗ. Có nhiều tế bào mô cứng thành dày hóa gỗ, các lỗ trao đổi rõ. Nhiều tinh thể calci oxalat hình kim, dài khoảng 0,1 mm và các đoạn gãy của chúng. Rải rác có các hạt tinh bột và nhiều mạch điểm.
Định tính
A. Đun sôi 0,10 g bột dược liệu với 1 ml dung dịch natri hydroxyd 10 % (TT) và 9 ml nước, rồi lọc. Thêm acid hydrocloric (TT) cho đến phản ứng hơi acid và 10 ml ether ethylic (TT), lắc. Lớp ether sẽ nhuộm màu vàng. Gạn riêng lớp ether, thêm 5 ml amoniac (TT), lắc. Lớp dung dịch amoniac sẽ nhuộm màu đỏ tím bền vững.
B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)
Bản mỏng: Silica gel G.
Dung môi khai triển: Ether dầu hỏa (30 °C đến 40 °C) - ethyl acetat - acid
acetic băng (7,5 : 2,5 : 0,25).
Dung dịch thử: Lấy khoảng 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml nước, lắc để nước thấm đều dược liệu, để yên 15 phút, nghiền bột dược liệu trong cối sứ thành bột ướt, thêm 40 ml methanol (TT), cho vào bình cầu miệng mài, đun sôi hồi lưu trên cách thủy trong 30 phút, lọc, làm bay hơi dung môi đến cạn. Thêm vào cắn 5 ml nước và 20 ml ether dầu hỏa (30 °C đến 60 °C) (TT), lắc khoảng 3 phút đến 5 phút, để lắng, gạn lấy phần dịch chiết ether dầu hỏa, làm bay hơi hết dung môi. Hòa cắn trong 2 ml methanol (TT) làm dung dịch thử.
Dung dịch đối chiếu: Lấy 5 g dược liệu rễ Ba kích (mẫu chuẩn) và tiến hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí, phun dung dịch kali hydroxyd 10 % trong ethanol (TT). Quan sát dưới ánh sáng thường. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết (2 đến 3 vết) màu đỏ, cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
C. Monotropein
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Phụ lục 5.3)
Trong sắc ký đồ phần Định lượng monotropein, dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với pic monotropein thu được từ dung dịch chuẩn.
D. Nystose
* Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Phụ lục 5.3)
Trong sắc ký đồ phần định lượng nystose, dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với pic nystose thu được từ dung dịch chuẩn.
* Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel F254.
Dung môi khai triển: Ethyl acetat – nước – acid formic – acid acetic băng (6 : 3 : 2 : 2).
Thuốc thử hiện màu: Cho từ từ 11 ml acid sulfuric (TT) vào 89 ml ethanol (TT).
Thêm 2,75 g -naphthol (TT) và 7 ml nước.
Dung dịch đối chiếu: Cân khoảng 5 mg nystose chuẩn vào bình định mức 50 ml. Thêm khoảng 35 ml methanol (TT) và lắc để hoà tan. Thêm methanol (TT) vừa đủ đến định mức và lắc đều.
Dung dịch thử: Lấy khoảng 0,5 g bột dược liệu rễ Ba kích vào bình nón dung tích 50 ml. Thêm 20 ml methanol (TT), lắc siêu âm trong 15 phút. Lọc qua giấy lọc, lấy dịch lọc làm dung dịch thử.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 15 µl dung dịch đối chiếu và 1,5
µl dung dịch thử. Trước khi triển khai sắc ký, thêm pha động vào 1 ngăn, bản mỏng để vào ngăn còn lại, đậy nắp bình và để yên 15 phút. Nghiêng bình sắc ký cẩn thận để dung môi khai triển tràn sang ngăn chứa bản mỏng. Triển khai sắc ký đến khi pha động đi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí, phun thuốc thử