Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Monotropein Trong Nguyên Liệu Và Dược Liệu

hiện màu, sấy bản mỏng ở nhiệt độ khoảng 100 oC đến khi xuất hiện vết. Quan sát bằng mắt thường. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết chính có cùng màu sắc và giá trị Rf với vết nystose trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn

Độ ẩm

Không quá 12,0 % (Phụ lục 9.6, 1 g, 100 oC, 5 giờ) Tro toàn phần

Không quá 6,0 % (Phụ lục 9.8).

Tỷ lệ vụn nát

Không quá 5,0 % (Phụ lục 12.12)

Tạp chất (Phụ lục 12.11)

Tạp chất khác: Không quá 1,0 %.

Tỷ lệ dược liệu xơ, hóa gỗ, đường kính dưới 0,3 cm: Không được có Chất chiết được trong dược liệu

Không được ít hơn 50,0 % tính theo dược liệu khô kiệt.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

Tiến hành theo phương pháp chiết lạnh (Phụ lục 12.10), dùng nước làm dung

môi.

Định lượng monotropein

Yêu cầu: Hàm lượng monotropein (C16H22O11) tính theo dược liệu khô kiệt không

được ít hơn 0,2 %.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Phụ lục 5.3)

Pha động: ethanol - acid phosphoric 0,5 % (5 : 95). Điều chỉnh tỷ lệ nếu cần.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg monotropein chuẩn và chuyển vào bình định mức 10 ml. Thêm 5 ml methanol (TT) và lắc để hoà tan. Thêm methanol (TT) vừa đủ đến định mức và lắc đều. Lấy 1,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 20 ml, thêm nước vừa đủ đến định mức, lắc đều.

Dung dịch thử: Nghiền dược liệu rễ Ba kích thành bột, rây qua rây 250 µm thu được bột dược liệu. Cân chính xác khoảng 1,2 g bột dược liệu và chuyển vào ống ly tâm thủy tinh có nắp, thêm 30 ml ethanol 40 % (TT), đậy nắp, lắc siêu âm 30 phút, ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch chiết vào bình định mức 100

ml, cắn còn lại đem chiết tiếp 2 lần, mỗi lần với 20 ml ethanol 40 % (TT), gộp các dịch chiết vào bình định mức trên, bổ sung ethanol 40 % (TT) đến vạch, lắc đều. Lấy 1,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 10 ml, thêm nước vừa đủ đến định mức, lắc đều.

Điều kiện sắc ký:

Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm).

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 237 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

Thể tích tiêm: 10 µl.

Cách tiến hành:

Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của các diện tích đáp ứng từ 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0 %, số đĩa lý thuyết của cột tính theo pic monotropein không được nhỏ hơn 4.000, hệ số đối xứng của pic monotropein phải từ 0,8 – 1,5

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.

Hàm lượng (%) monotropein (C16H22O11), tính theo chế phẩm khô kiệt được tính theo công thức sau đây:

trong đó:

𝑋 (%) =

𝑆𝑡

𝑆𝑐

𝐶𝑐

𝑚

× 1000 ×

100

(100 − 𝐴)

1000

× 100

ST, SC: diện tích pic monotropein trên sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng.

CC: nồng độ dung dịch chuẩn monotropein (mg/ml). m: lượng cân của mẫu thử (g).

A: độ ẩm của mẫu thử (%).

Định lượng nystose

Yêu cầu: Hàm lượng nystose (C24H42O21) tính theo dược liệu khô kiệt không được ít

hơn 2,0%.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Phụ lục 5.3)

Pha động: ethanol – nước (3 : 97). Điều chỉnh tỷ lệ nếu cần.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg nystose chuẩn và chuyển vào bình định mức 10 ml. Thêm 5 ml pha động và lắc để hoà tan. Thêm pha động vừa đủ đến định mức và lắc đều. Lấy 4,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 10 ml, thêm pha động vừa đủ đến định mức, lắc đều.

Dung dịch thử: Nghiền dược liệu rễ Ba kích thành bột mịn và rây qua rây 250

µm. Cân chính xác khoảng 1,0 g bột dược liệu rễ Ba kích vào bình nón nút mài 250 ml, thêm chính xác 100,0 ml pha động, đậy nắp, cân xác định khối lượng. Đun sôi hồi lưu trong cách thủy 30 phút, để nguội, cân lại, bổ sung pha động nếu thiếu so với khối lượng ban đầu.

Điều kiện sắc ký:

Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm).

Detector tán xạ bay hơi (Nhiệt độ hoá hơi: 90 ºC; Độ phát hiện: Gain 6; Áp suất

khí nitơ: 3,5 bar).

Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. Thể tích tiêm: 10 µl.

Cách tiến hành

Kiểm tra sự phu hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của các logarit tự nhiên của diện tích đáp ứng từ 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0 %, số đĩa lý thuyết của cột tính theo pic nystose không được nhỏ hơn 2.000.

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.

Hàm lượng (%) nystose (C24H42O41), tính theo dược liệu khô kiệt được tính theo công thức:

trong đó:

𝑋 (%) = 𝑒

𝑙𝑛𝐶

𝑐

(ln 𝑆𝑇×𝑙𝑛𝑆𝐶)

100

× ×

𝑚 × 1000

100

100 − 𝐴

1000

× 100

SC: diện tích pic nystose trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn ST: diện tích pic nystose trên sắc ký đồ của dung dịch thử CC: nồng độ nystose trong dung dịch chuẩn (µg/ml)

m: lượng cân mẫu thử (g).

A: hàm ẩm của dược liệu rễ Ba kích.

Chế biến

Có thể đào lấy rễ quanh năm. Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô

tới khi không dính tay, đập nhẹ cho bẹp, phơi đến khô hoặc sấy nhẹ đến khô.

Bào chế

Ba kích nhục: Lấy Ba kích sạch đồ kỹ hoặc luộc qua, khi còn đang nóng rút bỏ

lõi gỗ, cắt đoạn, phơi khô.

Diêm ba kích nhục: Lấy Ba kích sạch trộn với nước muối cho đều, đồ kỹ, rút lõi gỗ, cắt đoạn phơi khô. Cứ 100 kg Ba kích dùng 2 kg muối và lượng nước vừa đủ hoà tan, lọc trong.

Chích ba kích: Lấy Cam thảo giã dập, sắc lấy nước, bỏ bã. Cho Ba kích sạch vào, đun đến khi mềm xốp có thể rút lõi gỗ, lấy ra rút lõi khi còn nóng, cắt đoạn, phơi khô. Cứ 100 kg Ba kích dùng 6 kg Cam thảo.

Bảo quản

Để nơi khô, thoáng, tránh mốc, mọt.

Tính vị, quy kinh

Cam, tân, vi ôn. Vào kinh thận.

Công năng, chủ trị

Bổ thận dương, mạnh gân xương: Chủ trị: Liệt dương, di tinh, tử cung lạnh, phụ nữ khó mang thai, kinh nguyệt không đều, bụng dưới đau lạnh, phong thấp tê đau, gân xương mềm yếu.

Cách dùng, liều lượng

Ngày dùng từ 3 g đến 9 g. Dạng thuốc sắc. Thường phối hợp với một số vị thuốc

khác.

Kiêng kỵ

Âm hư hoả vượng, táo bón không nên dùng.

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN

4.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose

Các phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose được thẩm định tuân thủ theo đúng quy định của ICH Q2 R1 [52], và được thực hiện tại phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025, GLP – WHO, phòng thí nghiệm Tiền đánh giá của WHO.

4.1.1. Phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích

Dựa trên tài liệu tham khảo [49], [57], điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm và tính chất hấp thụ tia UV-VIS của monotropein, luận án đã lựa chọn và cố định điều kiện sắc ký: Cột RP 18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm: 10 µl; nhiệt độ cột: 25 oC; khảo sát bước sóng hấp thụ UV-VIS cực đại và thành phần pha động. Kết quả khảo sát cho thấy, monotropein hấp thụ UV-VIS cực đại tại bước sóng 237 nm và được lựa chọn. Monotropein và một base yếu [62], dựa trên 2 hệ pha động tham khảo được với thành phần là MeOH và acid phosphoric, luận án đã khảo sát và lựa chọn được pha động tối ưu là hỗn hợp MeOH – acid phosphoric 0,5 % theo tỷ lệ 5 : 95.

Để lựa chọn phương pháp chuẩn bị dung dịch thử của mẫu định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích, luận án đã lựa chọn 2 phương pháp chiết là lắc siêu âm và đun sôi hồi lưu – đây là 2 phương pháp thông dụng, dễ thực hiện và thường được áp dụng cho phương pháp định lượng các hoạt chất trong dược liệu. Dựa vào tính tan của monotropein trong nước, MeOH và EtOH, luận án lựa chọn khảo sát trên các dung môi chiết là: Nước, MeOH, EtOH 40 % và EtOH 60 %. Kết quả khảo sát phương pháp chiết và dung môi chiết monotropein từ dược liệu rễ Ba kích cho thấy phương pháp chiết bằng lắc siêu âm cho hàm lượng hoạt chất monotropein (%) cao hơn phương pháp chiết bằng đun sôi hồi lưu, trong đó dung môi EtOH 40 % là dung môi có khả năng chiết kiệt tốt nhất hoạt chất monotropein trong dược liệu rễ Ba kích.

Như vậy, phương pháp chiết bằng lắc siêu âm bằng dung môi chiết là EtOH 40% được lựa chọn làm phương pháp chuẩn bị dung dịch thử để định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích.

Phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và trong dược liệu rễ Ba kích bằng HPLC-DAD đã được tiến hành thẩm định theo đúng yêu cầu của ICH Q2(R1) [52] trên các chỉ tiêu: Độ thích hợp của hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu tốt với monotropein (phù hợp để định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích). Trong khoảng nồng độ từ 10,3 µg/ml – 107,4

µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic monotropein với hệ số tương quan r = 0,9999 (Bảng 3.2). Phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích đều có độ chính xác cao, thể hiện ở kết quả độ lặp lại trong ngày RSD ≤ 1,0 % và khác ngày RSD ≤ 1,3 % (Bảng

3.3 và Bảng 3.4). Kết quả tại Bảng 3.4, diện tích ngày 2 gấp khoảng gần 4 lần diện tích pic ngày 1 trong khi khối lượng cân gần như không khác nhau, bởi vì 2 ngày tiến hành trên 2 thiết bị HPLC khác nhau, 2 thiết bị này có độ nhạy và mức thang đo khác nhau. Phương pháp cũng có độ đúng tốt, thể hiện qua tỷ lệ (%) tìm lại trong nguyên liệu và trong dược liệu rễ Ba kích lần lượt là 98,3 % - 101,5 % và 98,2 % - 102,0 %, với độ lệch chuẩn tương đối của 9 kết quả lần lượt là 1,2 % và 1,3 % (< 2,0 %) (Bảng 3.5, Bảng 3.6). Phương pháp có giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 0,3 µg/ml và 0,9 µg/ml. LOD của phương pháp thấp hơn khoảng 167 lần so với nồng độ định lượng monotropein (50 µg/ml). Như vậy, phương pháp định tính, định lượng monotropein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector DAD đã được thẩm định và đảm bảo yêu cầu để áp dụng để kiểm tra chất lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích.

Theo yêu cầu của ICH Q2(R1) [52], các chỉ tiêu cần thẩm định đối với phương pháp xác định giới hạn tạp chất liên quan không định danh bao gồm: Độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện (LOD). Dựa trên phương pháp định tính, định lượng monotropein đã được xây dựng và thẩm định (có LOD là 0,3µg/ml), luận án đã áp dụng để kiểm tra tạp chất liên quan không định danh có trong nguyên liệu monotropein để thiết lập

chuẩn. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, xuất hiện 2 pic phụ có thời gian lưu lần lượt là 5,0 phút và 11,5 phút và tách hoàn toàn khỏi pic chính (Hệ số phân giải lần lượt là 11,5 và 5,3) (Hình 3.10 – c). Kết quả lặp lại tương tự với dung dịch thử trong Mục 3.1.6, xuất hiện 2 pic phụ có thời gian lưu 5,0 phút và 11,5 phút. Bên cạnh đó, dung dịch thử (mục định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích) có xuất hiện 1 pic phụ có thời gian lưu 9,0 phút (Hình 3.1). Để loại bỏ những pic có đáp ứng thấp ( 0,05 % so với pic chính trong dung dịch đối chiếu) có thể do ảnh hưởng của nhiễu đường nền, nên pic tại thời gian lưu 5,0 phút không là pic tạp chất (đáp ứng píc rất nhỏ - khoảng 0,01 % so với pic chính). Qua các kết quả trên cho thấy phương pháp định lượng monotropein là phù hợp để áp dụng kiểm tra giới hạn các tạp chất liên quan trong nguyên liệu monotropein.

4.1.2. Phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích

Cấu trúc của nystose bao gồm 3 phân tử fructose liên kết 1 phân tử glucose [66], không hấp thụ UV-VIS. Vì vậy để phát hiện nystose bằng HPLC, detector UV-VIS không được sử dụng. Luận án đã lựa chọn phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp HPLC-ELSD. Luận án tham khảo phương pháp định lượng nystose trong chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của Dược điển Trung Quốc [37] và Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông [47]: Phương pháp định lượng nystose trong Dược điển Trung Quốc sử dụng cột RP 18 – đây là cột sắc ký thông dụng trong các phòng thí nghiệm tại Việt Nam; còn phương pháp trong Bộ tiêu chuẩn dược liệu chuẩn Hồng Kông sử dụng cột HILIC – cột này ít thông dụng trong các phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Do đó, cột sắc ký RP18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) và pha động là hỗn hợp MeOH - Nước (3 : 97) được lựa chọn làm điều kiện sắc ký phân tích nystose.

Detector tán xạ bay hơi hoạt động theo cơ chế: Dịch rửa giải từ cột sắc ký đi vào đầu detector được trộn lẫn với khí nitơ ở trong bộ phận phun sương (nebulizer). Hỗn hợp đi qua một kim nhỏ được phân tán thành đám sương mù (dropler) kích thước đều nhau. Ở đây, dung môi được bay hơi loại khỏi hạt sương, hạt rắn mịn được hình thành. Các hạt rắn này đi cắt ngang chùm tia laser. Chùm tia laser bị tán xạ bởi các hạt rắn được phát hiện nhờ ống nhân quang. Như vậy, chất phân tích được phát hiện

nhờ ánh sáng tán xạ tạo ra tín hiệu điện. Đáp ứng của detector liên quan đến khối lượng của chất phân tích – nghĩa là diện tích pic sắc ký tỷ lệ thuận với khối lượng. Do đó, không thể xác định độ tinh khiết của pic trên sắc ký đồ thu được từ detector tán xạ bay hơi. Điều này lý giải tại sao luận án không xác định độ tinh khiết của pic nystose trong mục đánh giá độ đặc hiệu giống như xác định độ tinh khiết pic monotropein (xác định bằng detector tử ngoại).

Phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và trong dược liệu rễ Ba kích bằng HPLC-ELSD (Mục 2.3.1.2 – a) đã được tiến hành thẩm định theo đúng yêu cầu của ICH Q2(R1) [52] trên các chỉ tiêu: Độ thích hợp của hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đúng.

Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy, phương pháp có độ đặc hiệu với chất phân tích – nystose (phù hợp để định tính nystose). Trong khoảng nồng độ từ 113,1

µg/ml – 904,4 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa Ln(nồng độ) và Ln(diện tích pic) nystose với hệ số tương quan tuyến tính r = 0,9992 (Bảng 3.8). Phương pháp có độ chính xác cao, thể hiện ở kết quả độ lặp lại trong ngày RSD ≤ 1,1

% và khác ngày RSD ≤ 1,0 % (< 2,0 %) (Bảng 3.9 và Bảng 3.10). Phương pháp cho độ đúng tốt, thể hiện qua tỷ lệ (%) tìm lại trong nguyên liệu và trong dược liệu lần lượt đạt từ 99,7 % - 101,8 % và 98,8 % - 100,6 %) với độ lệch chuẩn tương đối RSD

= 0,7 % (< 2,0%) (Bảng 3.11 và Bảng 3.12). Như vậy, phương pháp định tính, định lượng nystose bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector ELSD đã được thẩm định và đảm bảo yêu cầu để áp dụng định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích.

Luận án không áp dụng phương pháp định tính, định lượng nystose bằng HPLC- ELSD để xác định tạp chất liên quan không định danh trong nguyên liệu do phương pháp này không có mối tương quan tuyến tính trực tiếp giữa nồng độ và diện tích pic nystose, mà có sự tuyến tính giữa Ln(nồng độ) và Ln(diện tích pic) trong một khoảng nồng độ nhất định. Khi khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp, kết quả thu được nồng độ chất phân tích thấp hơn nhiều lần so với giới hạn phát hiện của thiết bị. Bên cạnh đó, có thể có một số tạp chất không đáp ứng với detector ELSD.

Luận án sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để kiểm tra tạp chất liên quan

không định danh trong nguyên liệu nystose (Mục 2.3.3.1 – b) với điều kiện sắc ký,