Thí nghiệm tăng nhiệt độ: nhiệt độ nước thí nghiệm được tăng 20C mỗi giờ. Nhiệt độ được tăng bằng máy tăng nhiệt dùng điện có điều nhiệt độ tự động (heater).
Thí nghiệm giảm nhiệt độ: nhiệt độ nước thí nghiệm được giảm 20C mỗi giờ. Nhiệt độ được giảm bằng cách đặt các bể thí nghiệm trong phòng có máy lạnh và dùng thêm nước đá. Nước đá được cho vào các túi ni-long và cho vào bể thí nghiệm.
Điều chỉnh nhiệt: nhiệt độ khi tiến hành thí nghiệm là 280C, sau đó tiến hành nâng và giảm 20C/giờ. Trong khoảng thời gian duy trì nhiệt độ ổn định trong vòng 1 giờ để có nhiệt độ đúng như mong muốn của thí nghiệm, nâng hoặc giảm 20C/giờ có sự chênh lệch nhưng khoảng dao động không lớn so với điều kiện yêu cầu.
b. Theo dòi và ghi nhận số liệu
Trong thời gian thí nghiệm ghi nhận số cá chết và thí nghiệm sẽ dừng lại khi 2/3 số cá trong bể thí nghiệm chết (trừ số cá đã thu mẫu).
Trong thời gian tăng hay giảm nhiệt độ luôn theo dòi và ghi nhận các phản ứng của cá đồng thời thu mẫu (2 con/lần/bể) xác định các chỉ số huyết học và hoạt tính men ChE tại các thời điểm nhiệt độ cao như 34, 36, 38, 400C,... đến khi cá chết và thời điểm nhiệt độ thấp như 26, 24, 220C,... đến khi cá chết. Ngoài ra, đặc biệt lưu ý thu mẫu cá trước khi chết.
3.3.2 Xác định ảnh hưởng của MG và nhiệt độ lên các chỉ tiêu huyết học và men ChE.
a) Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thiết kế 2 nhân tố, nhân tố nhiệt độ và nhân tố nồng độ thuốc. Nhiệt độ sẽ được căn cứ vào kết quả của thí nghiệm 3.3.1 và nồng độ thuốc được dựa vào liều lượng sử dụng phổ biến và trên kết quả nghiên cứu của Lương Thị Diễm Trang (2009). Thí nghiệm được tiến hành trong bể composite có thể tích 200 lít. Mật độ cá thả là 30 con/bể, với thể tích nước là 120 lít/bể
Nghiệm thức 1 (NT1): nhiệt độ 220C và nồng độ MG là 0,15 ppm Nghiệm thức 2 (NT2): nhiệt độ 220C và nồng độ MG là 0,2 ppm Nghiệm thức 3 (NT3): nhiệt độ 280C và nồng độ MG là 0,15 ppm Nghiệm thức 4 (NT4): nhiệt độ 280C và nồng độ MG là 0,2 ppm Nghiệm thức 5 (NT5): nhiệt độ 340C và nồng độ MG là 0,15 ppm Nghiệm thức 6 (NT6): nhiệt độ 340C và nồng độ MG là 0,2 ppm
Sau khi thả cá vào 1 ngày tiến hành điều chỉnh nhiệt để có được nhiệt độ như mong muốn của thí nghiệm. Đối với các nghiệm thức ở nhiệt độ 220C được bố trí trong phòng lạnh và sử dụng máy lạnh để điều chỉnh nhiệt độ. Ở nghiệm thức 280C và 340C được bố trí trong phòng và có sử dụng thêm heater để điều chỉnh nhiệt độ thích hợp cho mỗi nghiệm thức.
Cá sau khi được chuyển vào các bể thí nghiệm 3-4 ngày tiến hành cho thuốc vào. Trước khi cho thuốc thì giảm 20% lượng nước trong bể và sau 6 giờ thì cấp lại lượng nước thay. Sau đó mỗi 3 ngày thay 30% lượng nước trong bể thí nghiệm. Trong thời gian thí nghiệm cá được cho ăn thức ăn viên công nghiệp và cho ăn theo nhu cầu của cá, hàng ngày cho ăn 2 lần (8 giờ và 14 giờ). Các bể được bố trí sục khí trong suốt thời gian thí nghiệm.
Phương pháp gây nhiễm: để có được các nồng độ thích hợp trong từng nghiệm thức, cách pha hóa chất MG được dưạ theo công thức: C1V1=C2V2
Để tránh gây sốc trực tiếp cho cá, MG sẽ được pha loãng trước khi cho vào bể. Nước dùng để pha loãng sẽ được lấy trực tiếp từ bể thí nghiệm, sau đó khuấy đều và cho vào bể, tránh đổ trực tiếp lên cá.
b) Thời gian thu mẫu
Lần thu 1: trước khi gây nhiễm MG
Lần thu 2: sau khi gây nhiễm MG 6 giờ (trước khi cấp thêm nước) Lần thu 3: sau khi gây nhiễm MG 72 giờ (trước khi thay nước) Lần thu 4: sau khi gây nhiễm MG 7 ngày (trước khi thay nước) Lần thu 5: sau khi gây nhiễm MG 14 ngày (trước khi thay nước)
Mỗi lần thu ngẫu nhiên 4 cá/bể. Lần thu cuối cùng thu tất cả số cá còn lại.
c) Phương pháp thu mẫu
Các yếu tố môi trường: thí nghiệm 3.3.1 và 3.3.2 thì nhiệt độ được theo dòi liên tục trong thời gian thí nghiệm và khi cần sẽ điều chỉnh sao cho phù hợp với nhiệt độ thí nghiệm bằng cách điều chỉnh máy lạnh và heater sau cho phù hợp với điều kiện của từng thí nghiệm. Riêng về pH và oxy của 2 thí nghiệm được đo định kỳ 3 ngày/lần bằng máy đo oxy và pH.
Phương pháp thu mẫu để phân tích các chỉ tiêu huyết học và men ChE
Thu mẫu phân tích huyết học: máu được thu trức tiếp từ động mạch chủ bằng ống tiêm 1 ml sau đó cho vào ống eppendoff để phân tích các chỉ tiêu: số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu, hematocrit, hemoglobine, MVC, MHC, MCHC.
Thu mẫu phân tích ChE: cá sẽ được thu não và máu để phân tích hoạt tính men ChE. Mẫu sau khi thu sẽ được giữ trong điều kiện nhiệt độ -80oC đến khi phân tích.
3.4 Phương pháp phân tích
3.4.1 Phương pháp phân tích mẫu
a) Phương pháp đếm hồng cầu: Dựa trên phương pháp đếm thông thường bằng buồng đếm Neubauer. Mẫu máu trước khi đếm phải được nhuộm trong dung dịch Natt Herrick bao gồm:
NaCl ........................................................................3,88 g
Na2 SO4 ..................................................................... 2,5 g
Na2HP O4.12H2O ...................................................2,91 g
KH2PO4 ...................................................................0,24 g
Formaline ..............................................................7,5 ml
Methyl violet............................................................ 0,1 g
Pha các hóa chất trên thành 1.000 ml với nước cất. Để qua đêm và lọc với giấy lọc sau đó chuẩn pH về 7,3 bằng máy chuẩn pH. Trữ trong chai màu nâu và trong tủ mát.
Dùng pipet hút 5 µl máu cho vào eppendoff chứa 995 µl dung dịch Natt & Herick (pha loãng 200 lần), lắc đều và để trong 3 phút..
Dùng pipet hút mẫu máu đã được pha loãng cho lên buồng đếm Neubauer và đếm trên kính hiển vi ở vật kính E40 ở 5 ô trên buồng đếm.
Mật độ hồng cầu được tính theo công thức: H = C x 10 x 5 x D
Trong đó: H là tổng số hồng cầu (tế bào/mm3)
C là tổng số hồng cầu đếm được trên 5 vùng đếm D là số lần pha loãng
|
Có thể bạn quan tâm!
-
Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của malachite green và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và men cholinesterase của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) - 1 -
Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của malachite green và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và men cholinesterase của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) - 2 -
Ảnh Hưởng Của Mg Đến Các Chỉ Tiêu Sinh Lý Và Sinh Hóa -
Ảnh Hưởng Của Nhiệt Độ Giảm Đến Các Chỉ Tiêu Sinh Lý Và Hoạt Tính Men Che Của Cá -
Ảnh Hưởng Của Mg Và Nhiệt Độ Lên Các Chỉ Tiêu Huyết Học -
Ảnh Hưởng Của Nhiệt Độ Và Mg Lên Hoạt Tính Của Men Che
Xem toàn bộ 81 trang tài liệu này.
Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Neubauer_improved_counting_ch
amber.jpg
b) Phương pháp đếm bạch cầu: Cho một giọt máu lên góc lam và dùng lamen dàn đều mẫu máu về phía trước. Nhanh chóng làm khô sau đó cố định bằng methanol 1–2 phút. Đợi khi mẫu khô (khoảng 15 phút) tiến hành nhuộm mẫu.
Mẫu nhuộm tiêu bản (Humason, 1979) (trích dẫn Lương Thị Diễm Trang, 2009) với các bước sau:
1. Nhuộm với dung dịch Wright trong 5 phút.
2. Ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 phút.
3. Nhuộm trong Giemasa trong 30 phút
4. Rửa bằng nước cất cho sạch thuốc nhuộm trên lam
5. Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15 phút.
6. Rửa sạch bằng nước cất và để khô tự nhiên.
Lam được quan sát ở kính hiển vi ở vật kính 100X. Các tế bào bạch cầu được xác định theo phương pháp của Supranee (1991) (trích dẫn Lương Thị Diễm Trang, 2009). Công thức tính tế bào bạch cầu
Tổng số bạch cầu: W = (h x H)/ (1500 - h)
Trong đó: h: Số bạch cầu đếm được trong tổng số 1.500 tế bào H: mật độ hồng cầu trong mẫu máu.
Giọt máu
Hướng tiếp xúc của lame
Lame tiếp xúc với giọt máu
Hướng di chuyển của lame
Hình 3.2 cách làm kính phết http://www.funsci.com/fun3_en/blood/blood.htm#17
c) Phương pháp đo hematorite (tỉ lệ huyết sắc tố%): theo phương pháp của Larsen và Snieszko (1961) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998) . Máu thu được cho vào ống thủy tinh (hematocrit tube) để đo tỉ lệ huyết sắc tố. Ly tâm hematocrit tube bằng máy ly tâm chuyên biệt trong 3 phút với tốc độ là 12.000 vòng/phút. Dùng vòng đo chiều dài có vạch từ 0 – 100% để xác định tỉ lệ huyết sắc tố. Phương pháp xác định các chỉ số liên quan đến hồng cầu
Thể tích hồng cầu (MCV)
MCV (µ3) = 10 x [tỉ lệ huyết cầu (%)/số lượng hồng cầu (106/mm3)]
Khối lượng trung bình của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCH)
MCH (pg) = 10 x [huyết sắc tố (g/100ml)/số lượng hồng cầu (10 6/mm3)]
Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCHC)
MCHC (%) = 100 x [tỉ lệ huyết cầu (%)/huyết sắc tố (g/100ml)]
Phương pháp đo hemoglobin: Được đo bằng thuốc thử Drabkin theo phương pháp của Oser (1965). Thành phần thuốc thử Drabkin bao gồm:
Cân 20 g K3Fe(CN)6 pha với nước cất thành 1000 ml HR I
Cân 75 g KHCO3 và 5g KCN pha với nước cất thành 1000 ml HR II Pha 10 ml (HRI) + 10 ml (HRII) với nước cất thành 1000ml Drabkin.
Dùng pipet hút 10 µl mẫu máu cho vào cuvet có chứa 2,5ml dung dịch Drabkin trong cuvet, lắc đều. Dung dich sẽ chuyển màu và đem so màu bằng máy đo quang phổ (UV spectrophotometer) ở bước sóng 540 nm và nhiệt độ phòng.
Số lượng huyết sắc tố Hemoglobin (mmol/l) được tính theo công thức: Hb(mmol/l) = (0,019 + 37,74a) x 0,621 Với a là mức độ hấp thụ ánh sáng Tính được lượng huyết sắc tố: Hb (g/100mL) = (A x 1,6125)
Phương pháp đo hoạt tính của enzym ChE: phân tích theo phương pháp của Ellman et al. (1961) có bổ sung.
Phương pháp tính hoạt tính của ChE não được thực hiện theo các bước sau:
- Lấy mẫu não: Cá sau khi lấy máu sẽ được gấy tê bằng cách dìm trong nước đá. Sau khi lấy não được chuyển sang đĩa petri lạnh và sạch. Máu cá tách khỏi não bằng cách lăn trên giấy thấm, sau đó cho vào ống eppendoff 1,5ml. Trữ lạnh ở - 80oC đến khi nghiền.
Nghiền mẫu: Mẫu não sau khi bỏ trong tủ đông -800C, đem đi rã đông trong nước đá. Nghiền mẫu bằng dung dịch đệm K2HPO4/KH2PO4 (bufer có pH 7.5).
Lấy mẫu não cho vào ống nghiệm + 1ml dd bufer sau đó tiến hành nghiền, tiếp tục cho vào 1ml bufer nghiền 2-3 phút cho thêm 1ml nữa (tráng máy nghiền) đến ml thứ 3 cho lên máy vortex lắc đều. Sau đó cho vào 2 ống eppendoff 2ml đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
Lưu ý: Sau khi nghiền xong mẫu, cây nghiền sẽ được rữa lại 1 lần bằng nước cất sau đó rữa lại bằng acetol rồi tiếp tục rữa lại bằng nước cất rồi mới sử dụng tiếp. Tất cả quá trình nghiền mẫu điều tiến hành trong điều kiện lạnh.
Sau khi ly tâm xong, lấy phần nước trong 1 ống cho vào ống eppendoff nhỏ
phân tích protein và 1 ống cho vào ống khác để phân tích men, đem bỏ trong tủ đông -800C đến khi phân tích.
Đo hoạt tính của enzyme Chuẩn bị hóa chất:
- Sodium phosphate (Na2HPO4/NaH2PO4) nồng độ 50 mM, pH=7,4.
Cân 1,4g Na2HPO4 + 250ml H2O
Cân 0,358g NaH2PO4 + 250ml H2O
Trộn lại được dd sodium phophate nồng đố 50mM, pH=7,4
- 167µL DTNB (5,5 dithiobis 2 notrobenzoic acid), M = 396,3g.
Có được 167mM DTNB cần 66.1mg DTNB +1ml dd sodium phophate pH=7,4. Có được 167mM đem đi pha loãng 1000 lần được dd 167 µl DTNB.
- 30mM cơ chất Acetythiocholine iodine (Substrate)
8,67mg Acetythiocholine iodine + 1ml sodium phophate.
Chú ý: khi phân tích thì cần sunbstrate nồng độ 1,5mM cần tính toán chuyển đổi về dúng nồng độ. Cụ thể theo công thức C1V1 = C2V2.
Trong quá trình phân tích sử dụng hóa chất acetythiocholine iodide (ATChI) như là cơ chất của ChE. ATChI bị phân hủy thành thiocholine và acetate bởi ChE. Thiocholine phản ứng với dithiobisnitrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng. Cường độ màu đậm dần theo thời gian và hoạt tính của ChE được đo bằng máy so màu quang phổ.
Phương trình phản ứng minh hoạ:
Acetylthiocholine iodide AChE thiocholine + acetate Thiocholine + dithiobisnitrobenzoate Sản phẩm có màu vàng
Hoạt tính của ChE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 412 nm trong 5 phút.
Bảng 3.1 Quá trình phân tích ChE
Mẫu trắng (µL) | Mẫu (µL) | |
DTNB (nồng độ cuối 150 µM) | 900 | 900 |
Sodium phosphate | 50 | / |
Mẫu | / | 50 |
Cơ chât (nồng độ cuối 1,5 mM) | 50 | 50 |
Đọc ở bước sóng 412 nm trong 5 phút | ||
Công thức tính:
R = Abs x pha loãng/{[Thể tích mẫu (ml) x 0,0136]/ protein (mg/ml)}
Trong đó: R = số mole cơ chất thủy phân/phút/malachite green protein. 0,0136 là hệ số ATChI bị chuyển hóa thành thiocholine và acetate
3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu phân tích giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và phân tích phương sai tìm sự khác biệt giữa các nghiệm thức (phân tích one-way Anova và phép thử Duncan) bằng phần mềm Excel và SPSS.
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên chỉ tiêu huyết học và men ChE lên cá tra
4.1.1 Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt động của cá
Tăng nhiệt độ: trong quá trình tăng nhiệt nhận thấy cá có những hoạt động như bơi lội nhanh hơn bình thường và tăng cường đớp khí. Các vây cử động liên tục, vây đuôi hoạt động rất nhanh, một số cá có biếu hiện muốn phóng ra khỏi bể. Biểu hiện này tăng theo sự gia tăng của nhiệt độ và máu cá cũng có màu đỏ đậm hơn, nhanh đặc hơn so với nhiệt độ trước đó. Cá bắt đầu chết khi nhiệt độ tăng lên 380C lúc này hoạt động của cá chậm dần và có biểu hiện mất nhớt, lờ đờ và đến 400C thì cá chết gần 50% và đến 420C cá chết gần100%.
Giảm nhiệt độ: khác với thí nghiệm tăng nhiệt ở thí nghiệm giảm nhiệt cá hoạt động chậm dần, vây đuôi và mang hoạt động chậm theo sự giảm dần của nhiệt độ. Máu cá lúc này có màu đỏ tươi hơn và chậm đạec hơn so với nhiệt độ ban đầu. Cá bắt đầu chết khi nhiệt độ ở nhiệt độ 160C và chết gần 100% ở 120C.
Bảng 4.1: Số cá chết khi tiến hành tăng và giảm nhiệt
Cá chết | Nhiệt độ (giảm) | Cá chết | |
28 | 0 | 28 | 0 |
30 | 0 | 26 | 0 |
32 | 0 | 24 | 0 |
34 | 0 | 22 | 0 |
36 | 0 | 20 | 0 |
38 | 2 | 18 | 0 |
40 | 8 | 16 | 3 |
42 | 15 | 14 | 7 |
44 | - | 12 | 17 |
Ghi chú: tổng số cá thí nghiệm 40 con/bể
4.1.2 Ảnh hưởng của tăng nhiệt độ đến các chỉ tiêu sinh lý và hoạt tính men ChE của cá
4.1.2.1 Các chỉ tiêu huyết học
Số lượng hồng cầu: kết quả thí nghiệm cho thấy thì số lượng hồng cầu có xu hướng gia tăng khi nhiệt độ tăng, vào thời điểm đối chứng số lượng hồng cầu dao động trong khoảng 2,54±0,13x106tế bào/mm3 và đạt cao nhất là ở nhiệt độ 420C (4,90±0,61106tế bào/mm3). Kết quả Xử lý thống kê cho thấy có sự khác