Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của malachite green và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và men cholinesterase của cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Các giá trị LC0 , LC50 and LC100 (mg/l) của malachite greens 6

Bảng 2.2: Giá trị LC50 của một số loài cá khác nhau khi tiếp xúc với MG 7

Bảng 4.1: Số cá chết khi tiến hành tăng và giảm nhiệt 22

Bảng 4.2: Biến động các chỉ tiêu huyết học khi tiến hành tăng nhiệt 24

Bảng 4.3: Hoạt tính của men ChE khi tiến hành tăng nhiệt 25

Bảng 4.4: Biến động các chỉ tiêu huyết học khi tiến hành giảm nhiệt 27

Bảng 4.5:Hoạt tính của men ChE khi tiến hành giảm nhiệt 28

Bảng 4.6: Biến động các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm 31

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và MG lên số lượng hồng cầu 33

Bảng 4.8:Ảnh hưởng của nhiệt độ và MG lên số lượng bạch cầu cầu 336

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ và MG lên tỉ lệ huyết cầu 36

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ và MG lên MCH 37

Bảng 4.11:Ảnh hưởng của nhiệt độ và MG lên MCHC 39

Bảng 4.12:Ảnh hưởng của nhiệt độ và MG lên MCV 40

Bảng 4.13:Ảnh hưởng của nhiệt độ và MG lên hemoglobin 41

Bảng 4.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ và MG lên hoạt tính của enzyme ChE

..............................................................43

Bảng 4.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ và MG lên hoạt tính của enzyme ChE 455

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Malachite green
LMG	Leucomalachite Green
ĐBSCL	Đồng bằng sông Cửu long
VSATTP	Vệ sinh an toàn thực phẩm
NTTS	Nuôi trồng thủy sản
KST	Ký sinh trùng
CPSH	Chế phẩm sinh học
AFB1	Aflatoxin B1
ChE	Cholinesterase
BuChE	Butyl cholineseterase
AChE	Acetylcholineseterase
NT	Nghiệm thức
MCV	Thể tích hồng cầu
MCH	Khối lượng hồng cầu
MCHC	Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu
DTNB	Dithiobisnitrobenzoate

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 81 trang tài liệu này.

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu

Trong những năm gần đây, nuôi trồng thủy sản đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh khác nhau như gia tăng diện tích, phát triển nhiều mô hình nuôi, tăng mức độ thâm canh với nhiều đối tượng nuôi khác nhau. Trong các đối tượng nuôi thì cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những đối tượng đang được chú ý phát triển ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) hiện nay. Tuy nhiên, do tập trung quá vào mức độ thâm canh và nâng cao năng suất nên đã làm gia tăng sự sử dụng thuốc và hóa chất để kiểm soát môi trường, phòng và trị bệnh ngày càng trở nên phổ biến. Thế nhưng, việc sản xuất, kinh doanh, sử dụng và quản lý thuốc, hóa chất và các chế phẩm sinh học dùng trong nuôi trồng thủy sản còn có nhiều hạn chế do sự hiểu biết của người nuôi, người cung cấp dịch vụ cũng như sự hỗ trợ của cơ quan khuyến ngư và nhà quản lý khác còn có giới hạn. Vấn đề tồn lưu kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản ngày càng trở nên phổ biến và là nguy cơ ảnh hưởng đến vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP). Hướng tới vấn đề VSATTP trong các sản phẩm thuỷ sản, Bộ Thủy sản đã ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ban hành ngày 24 tháng 2 năm 2005 quy định danh mục 17 loại hóa chất kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản, trong đó có Malachite green (MG).

MG đã được sử dụng rộng rãi từ lâu và được dùng rất phổ biến với tác dụng là xử lý nước, sát nấm (loại Saprolegnia ssp) cũng như để sát ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (Protozoa) và bệnh nấm ký sinh trên trứng cá, cá và các loại sò hến như phòng trị các bệnh nấm thủy mi, bệnh trùng quả dưa,… (Alderman, 2002; Srivastava et al, 2004).

Khi vào cơ thể, một phần MG chuyển hóa thành Leucomalachite Green (LMG), thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG có thể tồn tại trong thời gian dài (Bergwerff et al, 2005) và MG được xem là một chất có khả năng gây bệnh ung thư (Annalaura et al., 2005). Theo nhận định của của Srivastava et al. (2004) thì độc tính của MG sẽ càng cao khi nhiệt độ càng tăng. Thế nhưng trong quá trình sử dụng MG vào mục đích nuôi trồng thủy sản thì rất ít người nuôi xem xét tới tác động của nhiệt độ lên hóa chất này.

Từ thực tế trên, việc “Nghiên cứu ảnh hưởng của malachite green và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và men Cholinesterase trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” là cần thiết.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định khả năng chịu nhiệt của cá tra và sự thay đổi của các chỉ tiêu huyết huyết học và men ChE trong điều kiện nhiệt độ khác nhau.

- Tìm hiểu sự ảnh hưởng kết hợp của nhiệt độ và MG lên sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học như hồng cầu, bạch cầu, hematocrit, hemoglobine và men ChE của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus).

1.3 Nội dung của đề tài

- Xác định ngưỡng chịu đựng nhiệt độ và sự thay đổi của các chỉ tiêu sinh lý và hoạt tính của men ChE theo nhiệt độ của cá tra (Pansianodon hypophthalmus) giai đoạn giống.

- Xác định sự biến đổi của một số chỉ tiêu sinh lý, men ChE của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong các khoảng nhiệt độ khác nhau với nồng độ MG khác nhau.

1.4 Thời gian thực hiện

Từ tháng 9/2009 đến tháng 9/2010

Phần 2:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Malachite green (MG)

2.1.1 Sơ lược về MG

MG có tên hóa học là Triphenylmethane; một số tên thương mại khác là Aniline green; Bright green N; Malachite green G. sulfate; Malachite oxolate; Noxich; Victoria green B. Trong nuôi trồng thủy sản thì Malachite oxolate được sử dụng khá phổ biến và có công thức phân tử là: C52H54N4O12.

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của MG (Oxolate)

Nguồn http://www.tcieurope.eu/it/common/img-structure/A5100.gif

2.1.2 Đặc điểm hóa học

Malachite green hay triarylmethane dye có công thức hóa học là C23H26N2O, CI 42000, dạng tinh thể rắn được điều chế bởi một phần của benzaldehyde và hai phần của diemethylaniline dưới xúc tác của a-xít sulphuric hoặc là kẽm clorua.

MG có ở nhiều dạng nhưng chủ yếu là oxalate hoặc là ở dạng muối hydrochloride, tối thiểu hòa tan được 50% như một hỗn hợp của acetate và muối hydrochloride. MG hydrochloride là một sản phẩm công nghiệp và được tạo ra do sự kết tủa khi thêm kẽm chloride. Thuốc nhuộm này giống như một triphenylemethanes khác có thể tồn tại trong 2 dạng ion như là muối và rượu metilic hay pseudobase. Theo Albert (1979) nếu ở dạng pseudobase thì có khả năng xâm nhập vào tế bào làm hòa tan được nhiều chất béo (lipid). Độ ion hóa cố định (pK) của MG là 6,90. MG bị ion hóa 100% ở pH 4,0; 50% tại pH 6,9; 25% tại pH là 7,4 và 0% khi pH là 10,1. Ở dạng chuyển hóa của MG, LMG có cấu trúc giống như là chuổi aromatic amin có vai trò quan trọng trong quá trình tạo màu (trích dẫn bởi Srivastava et al., 2004).

Hình 2.2: Ba dạng của MG

Tính chất: MG là một loại thuốc nhuộm hữu cơ, màu xanh, kết tinh lấp lánh, có tính chất kiềm yếu, rất dễ tan trong nước, không có mùi đặc biệt, có khả năng oxy hóa rất mạnh, có tác dụng tiêu diệt sinh vật gây bệnh, đặc biệt là nấm gây bệnh. MG dùng để nhuộm tơ, vải, giấy, da trong công nghiệp. MG cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi trùng và bào tử của nó. Ngoài ra MG còn có khả năng hoà tan sắt, chì và một số kim loại khác, sẽ gây ngộ độc cho tôm, cá nếu dùng các dụng cụ bằng sắt, chì để bảo quản và pha chế lúc sử dụng. Khi đi vào cơ thể sinh vật MG bị phân huỷ thành chất chuyển hoá (metabolite) là LMG (Nguyễn Thuần Anh, 2006).

Cơ chế diệt trùng của MG: MG có thể can thiệp vào quá trình sinh tổng hợp protein của cơ thể sinh vật gây bệnh, đi đến tiêu diệt chúng (Bùi Quang Tề và ctv, 2004).

Tác dụng: Từ lâu, MG được xem là chất diệt trùng. MG được dùng khá rộng rãi để xử lý nước, bể và dụng cụ. MG cũng được sử dụng để chống lại bệnh nhiễm trùng do giun sán Dactylogyrus vastator ở cá chép (Cyprinus carpio), diệt trùng, sát nấm (loại saprolegnia ssp), sát ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa) (Alderman, 2002; Srivastava et al., 2004). Tùy vào đối tượng mà nồng độ và phương pháp sử dụng khác nhau. MG có tính độc với người sử dụng, nên chỉ dùng khi thật sự cần thiết (Bùi Quang Tề và ctv, 2004).

MG đã được người nuôi thủy sản trên thế giới sử dụng rộng rãi từ lâu để phòng và trị bệnh cho cá tôm và hến. Tại Canada trước 1992 các trại sản xuất cá giống cũng thường sử dụng MG để ngăn ngừa trứng cá bị nhiễm nấm. Ngày nay Canada cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong đó có Trung quốc và Việt Nam đều cấm ngặt việc dùng chất MG trong việc nuôi trồng thủy sản. Chloramphenicol, Nitrofurans, xanh Malachite được thấy liệt kê trong danh mục các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản Việt Nam. Tại Việt Nam thì MG có thể

được các hộ nuôi trồng thủy sản sử dụng để sát trùng ao hồ, để tắm cá trước khi thả chúng vào lồng nhằm mục đích ngừa cá bị nhiễm nấm hoặc nhiễm ký sinh trùng. Khi vào cơ thể cá, MG sẽ bị phân hủy ra thành chất chuyển hóa (metabolite) là LMG. Thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG có thể tồn tại trong một thời gian rất lâu dài trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm độc (Bergwerff et al., 2005).

Thí nghiệm cho thấy MG và LMG làm hại gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay đổi gene (mutagenic) và khả năng gây ung thu (carcinogenic) trên loài chuột thí nghiệm (Roberta et al., 2004). Qua việc thẩm định các kết quả trên, các nhà khoa học đưa ra kết luận rằng MG và LMG là 2 chất nguy hại có tiềm năng gây cancer cho người. Năm 2002 Canada cũng như nhiều quốc gia khác đã nhận thấy chất MG có thể là mối đe dọa cho sức khỏe nên bắt đầu đề ra những chương trình thử nghiệm MG ở các loại cá tôm nuôi bày bán ở thị trường. Các quốc gia trong khối Liên hiệp Âu châu và Úc châu ấn định ngạch số tối đa của MG và LMG trong thủy sản là phải ở mức 2 phần tỉ (ppb), tức là không được vượt quá 0.002mg/kg. Hoa kỳ và Canada thì cho áp dụng nguyên tắc zero tolerance, nghĩa là không chấp nhận sự hiện diện của bất dư lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG .

Khi MG vào cơ thể, nó được xem là một chất có khả năng gây bệnh ung thư nay cả hai trong môi trường vitro và vivo (Annalaura et al, 2005), MG ảnh hưởng đến sức khoẻ con người nên đã bị cấm sử dụng và được kiểm tra nghiêm ngặt về dư lượng có trong thực phẩm ở nhiều nước trên thế giới (Nguyễn Thuần Anh, 2006).

Hình 2.3: Sự biến đổi của MG

Nguồn http://www.restek.com/graphics/figure_fff_003-1.gif

2.2. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của MG lên một số đối tượng thủy sản

Các độc tính của MG sẽ tăng theo thời gian tiếp xúc dài, nhiệt độ và nồng độ cao. MG Làm thay đổi đáng kể các thông số huyết học của máu cá, tuy nhiên

MG vẫn được sử dụng trong một số trường hợp đặc biệt ở nồng độ thích hợp và thời điểm khi nhiệt độ thấp (Srivastava et al, 2004).

Srivastava et al. (1995) đã tiến hành nghiên cứu về tính độc của MG và những ảnh hưởng của MG lên các chỉ số huyết học ở cá da trơn (Heteropneustes fossilis) như hàm lượng canxi, protein trong huyết tương và hàm lượng cholesterol; các chỉ tiêu này được xem như là tiêu chuẩn đánh giá độc tính và

thời gian tiếp cá với MG. Thí nghiệm xác định giá trị LC0, LC50 và LC100 ở các thời điểm 24, 48 và 96 giờ trong khoảng nhiệt độ là 20,8±1,5 0C ở cá có khối

lượng là 35,8±4,25 g; chiều dài 15,3±2,50 cm, với mật độ cá thí nghiêm là 20-25 cá/bể (5 cá/10 L) trong suốt thời gian thí nghiệm luôn quan sát và ghi nhận các biểu hiện của cá, đồng thời các yếu tố khác như oxy, độc cứng, pH đều nằm trong khoảng thích hợp. Kết quả quan sát cho thấy khi tiếp xúc với MG cá hoạt động nhanh không bình thường, mang và ngực hoạt động rất nhanh lẹ, bơi lộ thất thường và chậm dần, hô hấp khó khăn.Giá trị LC50 tại các thờ điểm 24, 48, 72 và 96 giờ với các nồng độ tương ứng là 5,60; 1,40; 1,25 và 1,00 mg/l.

Tuy nhiên, ở các loài cá khác nhau và khoảng nhiệt độ khác nhau thì giá trị LC50 cũng khác nhau (Srivastava et al., 2004). Như vậy, độc tính của MG có liên quan đến nhiệt độ của nước. Ở nhiệt độ thấp cá, tôm có thể chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn. Đồng thời độc tính cũng tăng theo thời gian tiếp xúc và độc tính của MG tăng khi nhiệt độ tăng (Bảng 2.2).

Bảng 2.1: Các giá trị LC0, LC50 and LC100 (mg/l) của malachite green đối

với cá da trơn Heteropneustes fossilis

Thời gian

LC0	LC50	LC100
24	2.20	5.60	6.75
48	1.10	1.40	2.10
72	0.95	1.25	1.60
96	0.80	1.00	1.15

Nguồn: Srivastava et al., (1995)

Srivastava et al. (2004) nhận thấy có nhiều nghiên cứu về giá trị LC50 của MG tại các giai đoạn khác nhau ở cá. MG được xem là chất có khả năng gây độc ở một số cá thể ở một những loài cá khác nhau trong các giai đoạn khác nhau, và rất khó đem ra để so sánh vì nó chịu ảnh hưởng bởi các nhân tố khác nhau như là nhiệt độ, pH, độ cứng và hàm lượng oxy hòa tan trong nước thử nghiệm. Trên những biến đổi giá trị LC50 của MG trên cá da trơn nước ngọt Heteropneustes fossilis tại các thời gian và nồng độ khác nhau (Bảng 2.1 và 2.2) có thể nhận đinh rằng độc tính của MG tăng theo thời gian và nồng độ.