Mức Độ Đề Kháng Kháng Sinh Của 60 Chủng K. Peumoniae

MIC50 MIC90

Nhạy cảm

(S)

Kháng (R)

Mức độ kháng nhóm Beta lactamin của

chủng K. pneumoniae ESBL (+)

300

250

200

150

100

FOX

CFP

AZT

CTX

CTX/CLV

CAZ

CAZ/CLV

PIP

PIP/CLV

PEP

IPM

Biểu đồ 3.15: Mức độ đề kháng kháng sinh của 60 chủng K. peumoniae

Hình 3.1. Hình ảnh kết quả MIC trên môi trường đặc

3.3. Xác định tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 và quinolon nằm trên plasmid

3.3.1. Xác định tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 nằm trên plasmid

Bằng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR), với các cặp mồi đã thiết kế nhằm mục đích xác định các gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 nằm trên

plasmid: CTX-M-3, CTX-M-9, SHV và TEM, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu trên 107 chủng K. peumoniae có ESBLs.

a) b)

Hình 3.2. Kết quả PCR xác định sự có mặt của gen CTX-M 9 (a) và TEM(b)

M: Mẫu chuẩn (ADN 100bp)

1-7: 1- chứng dương; 2-chứng âm; 3-7: các chủng nghiên cứu (4690d, 4827d, 6022d, 6035d, 154d).

1-16: 1- chứng dương; 2-chứng âm;3-16: các chủng nghiên cứu (3499d, 3611d, 3700d, 3778d, 3794d, 3866d, 3870d, 3995d, 4105d, 4109d, 5774d, 5887d,

5892d, 6022d).

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng C3G nằm trên plasmid phát hiện bằng kỹ thuật PCR khá cao:

Bảng 3.27. Tỉ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng C3G nằm trên plasmid (n=107)

Gen mã hóa

Số chủng mang gen (n)	Tỉ lệ (%)
CTX-M-3	33	30,8
CTX-M-9	79	73,8
SHV	95	88,8
TEM	86	80,4
CTX-M (CTX-M-3+ CTX-M-9)	99	92,5

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 134 trang tài liệu này.

Tỷ lệ chủng mang gen mã hóa sự kháng C3G nằm trên plasmid khá cao, đặc biệt là CTX-M nói chung là 92,5%; SHV(88,8%) và thấp nhất là CTX-M 3 (30,8%).

CTX-M-3 CTX-M-9 SHV TEM CTX-M-3+ CTX-M-9

Tỷ lệ chủng K. pneumoniae mang gen mã

hóa sự kháng nhóm Beta-lactamin

100

88.8

92.5

80.4

73.8

30.8

CTX-M-3 CTX-M-9 SHV TEM CTX-M-3+

CTX-M-9

Biểu đồ 3.16. Tỉ lệ chủng mang gen mã hóa sự kháng C3G

3.3.2. Xác định tỷ lệ chủng K. pneumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm Quinolon (qnr) nằm trên plasmid

Bằng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR), với các cặp mồi đã thiết kế nhằm mục đích xác định các gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm Quinolon nằm trên plasmid: qnrA, qnrB, qnrS. Chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu trên 107 chủng K.pneumoniae. Kết quả thu được có 41/107 chủng có mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm Quinolon trên plasmid, chiếm tỷ lệ 38,3%.

Hình 3.3. Kết quả PCR xác định sự có mặt của gen kháng qnr nằm trên plasmid

M: Mẫu chuẩn (ADN 100bp)

1-3: Chứng dương qnrA; qnr B; qnr S

4,5,7,10,11,14,15: Chủng PCR (-): 3487d, 3611d, 3995d, 4619d, 4845d, 1231d,

1260d

6,8,912,13,16: Chủng PCR (+) : 3700d, 4336d, 4580d, , 4884d, 565d, 1307d.

Bảng 3.28. Phân bố các chủng mang gen kháng quinolon nằm trên plasmide (n=41)

Gen mã hóa

Số lượng (n)	Tỉ lệ (%)	p
qnrA	1	2,4	P< 0,05
qnrB	7	17
qnrS	33	80,6
Tổng	41	100

Kết quả cho thấy tỷ lệ chủng mang gen kháng Quinolon nằm trên plasmid trong nghiên cứu này khá cao. Tất cả 107 chủng đưa vào nghiên cứu về gen mã hóa sự kháng kháng sinh đều đã có chứa các gen mã hóa sự kháng C3G như kết quả phần trên, nhưng kết quả này cho thấy đồng thời có 38,3% số chủng mang gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm Quinolon (qnr); Trong đó chủ yếu là qnrS (80,6 %), qnrB (17 %) và gen qnrA chiếm tỉ lệ rất nhỏ (2,4 %).

Phân bố chủng K. pneumoniae mang gen mã hóa sự kháng nhóm Quinolon trên plasmid

2.4 17

80.6

qnrA qnrB qnrS

Biểu đồ 3.17. Phân bố các chủng mang gen kháng quinolon

3.3.3. Tỷ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr

Tổng hợp hai phần nghiên cứu trên, chúng tôi thấy, có một tỷ lệ khá cao chủng mang đồng thời nhiều gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm C3G và nhóm Quinolon nằm trên plasmid:

Bảng 3.29. Tỉ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr

Các gen mã hóa

Số lượng (n = 107)	Tỉ lệ %	p
qnr+CTX-M+SHV+TEM	24	22,4	p< 0,05
CTX-M+SHV+TEM	91	85
CTX-M-3+ CTX-M-9	11	10,3

CTX-M-3+CTX-9+SHV+TEM

8,4

Kết quả trên cho thấy: tỷ lệ các chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa kháng C3G là rất cao 85%, chủng đồng thời mang gen CTX-M-3 và CTX-M-9 là 10,3%, chủng mang tất cả các gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G là 8,4%. Trong số các chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G có 22,4% chủng mang cả gen mã hóa sự kháng sinh nhóm Quinolon(qnr).

Tỷ lệ chủng K. pneumoniae mang

nhiều gen mã hóa kháng C3G và quinolon

10.3

8.4

22.4

qnr+CTX-M+SHV+TEM

CTX-M+SHV+TEM

CTX-M-3+ CTX-M-9

CTX-M-3+CTX-9+SHV+TEM

Biểu đồ 3.18. Tỉ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr

3.3.4. Khẳng định các gen mã hóa kháng kháng sinh đã được phát hiện nằm trên plasmid bằng kỹ thuật Southern Blot.

Với điều kiện cho phép về kinh phí, bằng kỹ thuật Southern Blot, với enzym giới hạn S1, để cắt đặc hiệu trên ADN plasmid, chúng tôi đã tiến hành xác định các gen mã hóa được phát hiện nằm trên plasmid của 46 chủng.

a) b)

Hình 3.4.a và 3.4.b

3.4.a - Sản phẩm PCR đã được enzym giới hạn S1 phát hiện bằng điện di xung trường

M: Mẫu chuẩn ADN

1 – 19: 3487d, 3611d, 5233d, 3870d, 4690d, 5319d, 3431d, 5022d, 6035d, 861d,

1133d, 1307d, 1707d, 1713d, 2166d, 2371d, 2376d, 2523d, 276d.

3.4.b - Kết quả của kỹ thuật Southern Blot: làm xuất hiện các mảnh cắt của ADN plasmid .

7- 19: 3431d, 5022d, 6035d, 861d, 1133d, 1307d, 1707d, 1713d, 2166d, 2371d,

2376d, 2523d, 276d được phát hiện bằng kỹ thuật Southern Blot

Hình ảnh các băng hiện rõ trên ảnh 17a và 17b, cho biết các ADN của đoạn gen khuếch đại bằng kỹ thuật PCR đã được cắt bởi các enzym đặc hiệu cho ADN plasmid là S1, xác định chắc chắn các gen này nằm trên plasmid.

Chương 4 BÀN LUẬN‌‌

4.1. Đặc điểm phân bố các chủng vi khuẩn gây bệnh trong nhiễm khuẩn hô hấp ở bệnh nhi 0 đến 6 tuổi và một số yếu tố liên quan

Phương pháp thu thập mẫu trong đề tài này là thu thập mẫu thuận tiện, chính vì vậy mà nó mang những ưu điểm và những hạn chế nhất định:

- Ưu điểm: Mẫu được chỉ định làm theo thường quy nên quy trình lấy mẫu, vận chuyển, bàn giao mẫu cho phòng xét nghiệm và thực hiện xét nghiệm được làm theo hướng dẫn thường quy của bệnh viện tiết kiệm nhiều công sức cũng như thời gian và kinh phí cho nghiên cứu. Thời gian thu thập mẫu kéo dài cho tới khi đủ cỡ mẫu nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu trong một năm thì đủ số lượng mẫu dự kiến và thời gian cho phân tích một số yếu tố liên quan.

- Hạn chế: Thu thập mẫu thuận tiện theo thường quy do rất nhiều người thực hiện kỹ thuật, kỹ năng và độ thành thạo rất khác nhau sẽ không kiểm soát được kỹ thuật thu thập mẫu và thời gian vận chuyển mẫu có đảm bảo hay không, điều đó có ảnh hưởng tới tỷ lệ phân lập tác nhân gây bệnh và kết quả của nghiên cứu về mặt tác nhân. Đây cũng chính là lý do mà nghiên cứu của chúng tôi chỉ phân lập được

1.181 mẫu dương tính với vi khuẩn trong số 3.567 mẫu.

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập tác nhân trong đề tài là phương pháp cấy đếm. Đây là phương pháp tối ưu cho chẩn đoán các căn nguyên gây nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính. Sở dĩ như vậy là vì đường hô hấp mở thông với bên ngoài nên đường hô hấp sẽ có rất nhiều các tác nhân gây bệnh bình thường là sống cộng sinh, khi có điều kiện thuận lợi trở thành tác nhân gây bệnh thể hiện bằng số lượng có mặt của tác nhân trong đường hô hấp.

Kỹ thuật định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ được thực hiện ở phòng xét nghiệm hiện đại của Bệnh viện Nhi trung ương và kỹ thuật xác định ESBL, kỹ thuật xác định gen kháng kháng sinh tại Phòng nghiên cứu kháng thuốc của Khoa vi sinh tại Bệnh viện Several – Hàn quốc theo tiêu chuẩn của Viện tiêu chuẩn xét nghiệm lâm sàng quốc tế (CLSI) nên kết quả đảm bảo độ tin cậy cao [85].