37
(17,0 mg, tR 38,5 phút), GS2 (9,0 mg, tR 42,1 phút) và GS7 (14,0 mg, tR 41,1 phút) thu được từ phần GS2F1B sử dụng hệ thống sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC): cột J_sphere H-80 (150 × 20 mm), điều kiện dung môi acetonitrile 40%. Các hợp chất GS3 (5,0 mg, tR 44,7 phút) và GS4 (5,0 mg, tR 49,4 phút) được thu được từ phần GS2F1D trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm), điều kiện dung môi là 40% acetonitrile. Phân đoạn GS2F1E được phân tách trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm), điều kiện dung môi acetonitrile 35% cho các hợp chất GS10 (5,0 mg, tR 37,8 phút) và GS12 (12,0 mg, tR 35,7 phút). Hợp chất GS11 (72,0 mg, tR 34,3 phút) được tinh chế từ phân đoạn GS2F1C bằng hệ thống HPLC: cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm), điều kiện dung môi acetonitrile 35%. Phân đoạn GS2G được sắc ký trên cột RP-18 bằng hệ dung môi rửa giải MeOH: H2O (4:1, v:v) cho bốn phân đoạn nhỏ hơn, GS2G1-GS2G4. GS2G3 được tinh chế trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm), điều kiện dung môi acetonitrile 35% cho hợp chất GS5 (14,0 mg, tR 39,7 phút) và GS9 (20,0 mg, tR 44,7 phút). Phân đoạn GS2G4 được tinh chế trên cột J-sphere H-80 (150
× 20 mm), điều kiện dung môi acetonitrile 35%, thu được hợp chất GS6 (30,0 mg, tR 31,5 phút) và GS8 (19,0 mg, tR 33,4 phút). Lớp nước GSL4 được cho qua cột Diaion- HP20, sử dụng hệ dung môi rửa giải methanol : nước lần lượt là 25%, 50% và 100% thu được ba phân đoạn GS4A, GS4B và GS4C. Phân đoạn GS4C cho chạy sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CHCl3: MeOH (20:1, 10:1, 5:1, 1:1, v:v) cho bốn phân đoạn nhỏ hơn, GS4C1, GS4C2, GS4C3 và GS4C4. GS4C4 được sắc ký trên cột rửa giải RP-18 sử dụng hệ dung môi rửa giải methanol:nước (2:1, v:v) cho năm phân đoạn GS4C4A, GS4C4B, GS4C4C, GS4C4C và GS4C4E. Các hợp chất GS14 (5,0 g) và GS16 (40,0 mg) thu được từ phân đoạn GS4C4B trên cột rửa giải RP-18 bằng hệ dung môi acetone: nước (0,8:1, v:v). Các hợp chất GS13 (100,0 mg) và GS15 (5,0 mg) được tinh chế từ phân đoạn GS4C4E trên cột RP-18 rửa giải bằng hệ dung môi acetone:nước (1:1, v:v).
38
A : acetone ACN : acetonitrile
C : chloroform H : n-hexane Silica gel c.c : sắc ký cột pha thường M : methanol
Gymnema sylvestre (thân và lá, 4,0 kg)
Chiết với methanol (3 lần, mỗi lần 10L trong 3h)
Cặn methanol (450,0 g )
HPLC RP-18 c.c
: săc ký lỏng hiệu năng cao W
: săc ký cột pha đảo tR
: water
: thời gian lưu (phút)
Bổ sung 2L nước và chiết phân lớp với các dung môi theo tỉ lệ 1:1
n-hexane
CH2Cl2
EtOAc Nước
GSL1
(47,0 g)
GSL2
(60,0 g)
Silica gel c.c
H:A gradident 40:1→0:1
GSL3
(27,0 g)
MW:25%
MW: 50%
GSL4
Diaion HP20 M:W 0%→100%
M 100%
H:A 40:1 H:A 20:1 H:A 10:1
H:A 5:1
H:A 2,5:1
H:A 1:1
HA 0:1
GS4A
GS4B
GS4C
GS2A
GS2B GS2C
GS2D
GS2E
GS2F
C:M 11:1
GS2G
RP-18, M:W 4:1
Silica gel c.c, C:M gradident 20:1→1:1 | ||
C:M 20:1 | C:M 10:1 | C:M 5:1 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Các Nghiên Cứu Về Hoạt Tính Sinh Học Của Chi Gymnema -
Tình Hình Nghiên Cứu Về Chi Gymnema Ở Việt Nam -
Phương Pháp Phân Lập Các Hợp Chất -
Các Thông Số Vật Lí Của Các Hợp Chất Phân Lập Được Từ Loài G. Latifolium -
Xác Định Cấu Trúc Của Các Hợp Chất Phân Lập Được Từ Loài G. Sylvestre -
Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase và α-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre Retz. R.BR. EX SM. và dây thìa canh lá to - Gymnema latifolium Wall. EX wight - 10
Xem toàn bộ 255 trang tài liệu này.
C:M 1:1
GS4C1 GS4C2 GS4C3 GS4C4
GS2F1
RP-18 c.c, M:W 4:1
GS2F2
GS2F3
GS2F4 GS2G1
GS2G2 GS2G3
HPLC, 35% ACN
GS2G4
HPLC, 35% ACN
RP-18 c.c, M:W 2:1
tR 39,7 tR 44,7
tR 31,5 tR 33,4
GS4C4A GS4C4B GS4C4C GS4C4D GS4C4E
GS2F1A
GS2F1B GS2F1C GS2F1D
GS2F1E
GS5
GS9
GS6
GS8
HPLC 40% ACN
HPLC 35% ACN
HPLC 40% ACN
HPLC 35% ACN
(14,0 mg)
(20,0 mg)
(30,0 mg)
(19,0 mg)
RP-18 c.c A:W 0,8:1
RP-18 c.c A:W 1:1
tR 38,5 tR 41,1 tR 42,1
tR 34,3
tR 44,7
tR 49,4
tR 35,7 tR 37,8
GS1
(17,0 mg)
GS7 GS2 GS11
(14,0 mg) (9,0 mg) (72,0 mg)
GS3
(5,0 mg)
GS4 GS12
(5,0 mg) (12,0 mg)
GS10
(5,0 mg)
GS16
(40,0 mg)
GS14
(5,0 mg)
GS15
(5,0 mg)
GS13
(100 mg)
Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G. sylvestre
2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài G. latifolium
Thân và lá loài G. latifolium được thái nhỏ, phơi khô, nghiền mịn thu được 4,0 kg bột khô. Bột này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 8 L) bằng thiết bị chiết siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 3 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 400 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hòa vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate, loại bỏ dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn n-hexane (GLL1, 50,0 g), CH2Cl2 (GLL2, 52,0 g), ethyl acetate (GLL3, 30,0 g) và lớp nước (GLL4).
Cặn chiết GLL2 được tiến hành sắc ký trên cột silica gel rửa giải bằng dung môi gradient n-hexan:acetone (40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 và 0:1, v:v) cho sáu phân đoạn, kí hiệu từ GL2A-GL2F. Phân đoạn GL2D được sắc ký trên cột silica gel rửa giải bằng chloroform: MeOH (11:1, v:v) cho bốn phân đoạn, GL2D1-GL2D4. GL2D1 được sắc ký trên cột RP-18 sử dụng hệ dung môi methanol:nước (3:1, v:v) thu được bốn phân đoạn nhỏ hơn, kí hiệu từ GL2D1A đến GL2D1D. Hợp chất GL1 (15,0 mg, tR 34,2 phút ) thu được từ phân đoạn GL2D1B bằng hệ thống sắc ký HPLC: J-sphere, cột H-80 (150 x 20 mm), điều kiện dung môi 48% acetonitrile. Các hợp chất GL3 (13,3 mg, tR 39,1 phút) và GL5 (14,2 mg, tR 41,9 phút) thu được từ phần GL2D1C bằng hệ thống HPLC sử dụng hệ dung môi rửa giải 48% acetonitrile. Phần GL2D3 được sắc ký trên cột pha đảo bằng cách sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH: H2O (4:1, v:v), cho các phân đoạn GL2D3A, GL2D3B và GL2D3C. Hợp chất GL4 (16,0 mg, tR 42,2 phút) thu được từ GL2D3A sử dụng hệ thống HPLC, điều kiện dung môi 48% acetonitrile. Phân đoạn GL2E được sắc ký trên cột rửa giải RP-18 với MeOH: H2O (3:1, v:v) cho bốn phân đoạn GL2E1 - GL2E4. Phân đoạn GL2E1 được sắc ký bằng HPLC, điều kiện dung môi 48% acetonitrile cho hợp chất GL2 (17,0 mg, tR 53,6 phút) và GL6 (11,6 mg, tR 32,6 phút). Lớp nước GLL4 được cho qua cột Diaion- HP20, sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O lần lượt là 25%, 50%, 75% và 100% thu được bốn phân đoạn GL4A, GL4B, GL4C và GL-4D. Phân đoạn GL4C được tiến hành sắc ký trên cột silica gel rửa giải bằng dung môi gradient dichloromethane: methanol (20:1, 10:1, 5:1 và 0:1, v:v) cho bốn phân đoạn, kí hiệu từ GL4C1-GL4C4. Phân đoạn GL4C4 được sắc ký trên cột silica gel rửa giải bằng chloroform: methanol:nước (4:1:0,1, v:v:v) cho ba phân đoạn, GL4C4A-GL4C4C. Phân đoạn
GL4C4C được sắc ký trên cột RP-18 sử dụng hệ dung môi acetone:nước (0,8:1, v:v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, GL4C4C1, GL4C4C2 và GL4C4C3. Hợp chất GL8 (20,3 mg, tR 54,0 phút) thu được bằng cách tinh chế phân đoạn GL4C4C1 trên hệ thống HPLC: J-sphere, cột H-80 (150x20 mm), điều kiện dung môi 30% acetonitrile. Hợp chất GL7 (12,5 mg, tR 39,1 phút) thu được bằng cách tinh chế phân đoạn GL4C4C3 trên hệ thống HPLC: J-sphere, cột H-80 (150x20 mm), điều kiện dung môi 35% acetonitrile.
41
A : acetone ACN : acetonitrile
C : chloroform H : n-hexane Silica gel c,c : sắc ký cột pha thường M : methanol
Gymnema latifolium (thân và lá, 4,0 kg)
Chiết siêu âm với methanol (3 lần, mỗi lần 8L trong 3h)
HPLC RP-18 c,c
: săc ký lỏng hiệu năng cao W
: săc ký cột pha đảo tR
: water
: thời gian lưu (phút)
Cặn chiết methanol GLL, (400 g )
Bổ sung 2L nước và chiết phân lớp với các dung môi theo tỉ lệ 1:1
n-hexane dichloromethane ethyl acetate cặn nước
GLL1
(50,0 g)
GLL2
(52,0 g)
GLL3
(30,0 g)
GLL4
Silica gel c.c
H:A gradient 10:1→0:1
Diaion HP-20 M:W, 0%→100%
H:A 40:1
H:A 20:1
H:A 10:1
H:A 5:1
HA 1:1
Acetone
MW:25%
MW: 50%
MW:75%
M 100%
GL2A
GL2B
GL2C
GL2D
GL2E
GL2F
GL4A
GL4B
GL4C
GL4D
GL2D1
RP-18 c,c M:W 3:1
GL2D2
Silica gel c.c C:M 11:1
GL2D3
RP18 c, c M:W 4:1
GL2D4
RP-18 c,c M:W 3:1
GL2E1 GL2E2 GL2E3
HPLC 42%ACN
GL2E4
GL4C1 GL-4C2
GL-4C3
C:M 1:1
Silica gel c.c, C:M gradient 20:1→0:1 | ||
C:M 20:1 | C:M 10:1 | C:M 5:1 |
GL-4C4
Silica gel c, c, CMW 4/1/0,1
GL2D1A GL2D1B
HPLC
GL2D1C GL2D1D GL2D3A GL2D3B GL2D3C
HPLC HPLC,
tR 32,8
GL6
11,6 mg
tR 53,6
GL2
17,0 mg
GL4C4A
GL4C4B
GL4C4C
48%ACN
tR 34,2
48%ACN
tR 39,1 tR 41,9
48%ACN tR 42,2
(1,5 g)
(1,0 g)
(1,4 g)
RP-18 c.c,, A:W 0,8:1
GL1 GL3
GL5
GL4
(15,0 mg)(13,3 mg)
(14,2 mg)
(16,0 mg)
GL-4C4C1 GL-4C4C2 GL-4C4C3
HPLC 30%ACN
HPLC 35%ACN
tR 54,0 tR 39,1
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G.latifolium
GL8
(20,3 mg)
GL7
(15,0 mg)
2.4. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được
2.4.1. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre
2.4.1.1. Hợp chất GS1: gymsyloside A (hợp chất mới)
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 - 20,0o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS: m/z 935,4986 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C47H76O17Na]+ : 935,4975). Công thức phân tử: C47H76O17; M = 912.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.1.
2.4.1.2. Hợp chất GS2: gymsyloside B (hợp chất mới)
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 + 35,0o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 935,4996 [M+Na]+, (tính toán lý thuyết [C47H76O17Na]+: 935,4975).
Công thức phân tử: C47H76O17, M = 912.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.2.
2.4.1.3. Hợp chất GS3: gymsyloside C (hợp chất mới)
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 + 80,0o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 1079,5769 [M+Na]+, (tính toán lý thuyết [C54H88O20Na]+: 1079,5767).
Công thức phân tử: C54H88O20; M = 1056.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.3.
2.4.1.4. Hợp chất GS4: gymsyloside D (hợp chất mới)
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 + 58,7 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 1079,5778 [M+Na]+, tính toán lý thuyết [C54H88O20Na]+: 1079,5769).
Công thức phân tử: C54H88O20; M = 1056.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.4.
2.4.1.5. Hợp chất GS5:gymsyloside E (hợp chất mới)
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 +54,0 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 1097,5530 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C54H88O20Na]+: 1097,5503).
Công thức phân tử: C54H88O20; M = 1074.
Số liệu phổ 1H- và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.5.
2.4.1.6. Hợp chất GS6: gymnepregoside R (hợp chất mới)
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 +110,0 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 1241,6309 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C60H98O25Na]+: 1241,6289).
Công thức phân tử: C60H98O25; M = 1218.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.6.
2.4.1.7. Hợp chất GS7: gymnepregoside T (hợp chất mới)
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 +31,0 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 1037,5299 [M+Na]+, (tính toán lý thuyết cho công thức [C51H82O20Na]+: 1037,5292).
Công thức phân tử: C51H82O20; M = 1014.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.7.
2.4.1.8. Hợp chất GS8: vetircilloside M
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 +105,7 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 1263,6148 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C62H96O25Na]+: 1263,6133).
Công thức phân tử: C62H96O25; M = 1240.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.8
2.4.1.9. Hợp chất GS9: verticilloside D
D
Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 + 30,5 (c 0,1, MeOH).
Công thức phân tử: C57H92O25; M = 1176.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.9.
2.4.1.10. Hợp chất GS10: gymnepregoside F
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 +12,0 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 997,5318[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C49H82O19Na]+ : 997,5343).
Công thức phân tử: C49H82O19; M = 974.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.10.
2.4.1.11. Hợp chất GS11: 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 +15,0 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 1127,5766 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C58H88O20Na]+ : 1127,5761).
Công thức phân tử: C58H88O20; M = 1104.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.11.
2.4.1.12. Hợp chất GS12: stephanoside I
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 +30,0 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 1127,5771[M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C58H88O20Na]+ 1127,5761).
Công thức phân tử: C58H88O20; M = 1104.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.12.
2.4.1.13. Hợp chất GS13:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 -8.0 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 965,5094 [M+H]+ (tính toán lý thuyết [C48H78O18H]+ : 965,5080). Công thức phân tử: C48H78O18; M = 942.
Số liệu phổ 1H và 13H NMR (CD3OD): xem Bảng 3.13.
2.4.1.14. Hợp chất GS14: gymnemoside-W1
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 -45.0 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 967,5236 [M+Na]+, (tính toán lý thuyết cho công thức [C48H80O18Na]+: 967,5237).
Công thức phân tử: C48H80O18; M = 944.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.14.
2.4.1.15. Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester
D
Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực [ ] 2 5 -10.0 o (c 0,1, MeOH).
HR-ESI-MS tại m/z 1097,5521 [M+H]+ (tính toán lý thuyết [C53H86O22Na]+: 1097,5503).
Công thức phân tử: C53H86O22; M = 1074.
Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.15.