Phương Pháp Phân Lập Các Hợp Chất

trong của phân tử cơ chất (tinh bột và glycogen) một cách ngẫu nhiên và vì thế gọi là enzyme nội bào. Enzyme α-amylase còn có các tên đồng nghĩa (synonym) khác như glycogenase, endeamylase, clarase, maxamyl,… Enzyme α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn song với tốc độ rất chậm.

Quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme α-amylase là quá trình đa giai đoạn:

+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin).

+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không màu với iode. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose.

+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải tới maltotetrose, maltotriose và maltose.

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose và dextrin phân tử thấp.

1.3.3. Enzyme α-glucosidase (EC 3.2.1.20)

Enzyme α-glucosidase còn có những tên gọi khác như maltase, transglucosidase, glucoinvertase, nitrophenyl α-D-glucosidase, glucosidosucrase, α- glucopyranosidase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân).

Enzyme α-glucosidase là một enzyme hoạt động theo cơ chế exohydrolysis, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside giải phóng các phân tử α-D- glucose [64]. Chất nền đặc trưng của enzyme α-glucosidase là các disaccharide, oligosaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside khác [61], [65].

Enzyme α-glucosidase là một trong những enzyme thuộc lớp glycoside hydrolase, glycoside hydrolase là một lớp các enzyme thường tách liên kết glycoside giữa 2 phân tử carbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer tự nhiên. Các enzyme này có khả năng bẻ gãy các liên kết glycoside nhanh hơn 1017 lần so với phản ứng không có enzyme xúc tác [66]. Khi thức ăn được hấp

thu vào cơ thể thì các carbohydrate trong thức ăn được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme ở ruột non. Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid. Enzyme α-glucosidase ở màng ruột non lại tiếp tục phân hóa các olisaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu [60, 67, 68].

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm

Thân và lá loài dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Sm.) được thu hái tại xã Hải Lộc, huyện Hải Hậu, Nam Định, Việt Nam vào tháng 11 năm 2015. Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản NCCT-P20 được lưu tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1. Dây thìa canh (G. sylvestre)

2.1.2. Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight

Thân và lá loài lòa ty lá rộng, hay còn gọi là dây thìa canh lá to (G. latifolium Wall. ex Wight.) được thu hái tại Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội vào tháng 4 năm 2017. Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản NCCT-P76 được lưu tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.2. Dây thìa canh lá to (G. latifolium)

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (0,25 mm, Merck), RP-18 F254s (0,25 mm, Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm và dùng thuốc thử là dung dịch sulfuric acid 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

2.2.1.2. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel có cỡ hạt là 0,040 – 0,063 mm (230 - 400 mesh), pha đảo sử dụng loại RP-18 (30 - 50 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.); Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.).

2.2.1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện trên máy AGILENT 1200, khoa Dược, trường đại học Yonsei, Hàn Quốc.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên cơ sở sử dụng các phép xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. Các phương pháp đo được sử dụng gồm có:

2.2.2.1. Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS tại trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc.

2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR được đo trên máy đo trên máy Varian 400 MHz của Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc. Chất nội chuẩn là TMS (Tetramethyl Silan). Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H NMR, 13C NMR và DEPT.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và ROESY.

Dung môi được sử dụng là CD3OD. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử.

2.2.2.3. Độ quay cực

Độ quay cực ([α]D) được đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.2.4. Phương pháp xác định đường

Như đã trình bày ở phần tổng quan, thành phần hóa học chính của chi Gymnema là các saponin với chuỗi đường từ 2-6 đơn vị monosaccarit. Ngoài các đường quen thuộc như D-glucose, D-xylose thì còn có sự xuất hiện của một bộ phận lớn các đơn vị giả đường trong đó một số nhóm hydroxyl bị chuyển hóa thành CH2 hoặc methyl hóa. Do đó, việc xác định loại đường, chuỗi đường, cấu hình đường và vị trí gắn là phần vô cùng quan trọng trong quá trình xây dựng cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được. Trình tự xác định đường được thực hiện như sau:

 Nhận dạng loại đường bằng phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

- Nhận dạng đường đơn thông qua giá trị độ chuyển dịch hóa học cacbon và proton, đặc biệt là xác định cấu hình α/β của nhóm OH-hemiacetal thông qua hằng số tương tác của proton anome (J1-2) cũng như xác định lập thể các vị trí trong từng phân tử đường bằng dạng tín hiệu và hằng số tương tác J của các proton trong từng phân tử đường.

- So sánh độ chuyển dịch hóa học δC của các đường thu được với các tài liệu tham khảo về chi và loài.

- Kiểm tra lại cấu trúc hóa học của từng phân tử đường đơn bằng phổ HSQC kết hợp với phổ 1H-1H COSY để nối mạch cacbon cũng như gán chính xác các giá trị độ dịch chuyển hóa học của từng vị trí, trong đó có sự hỗ trợ thêm của phổ HMBC. Việc xác định chuỗi đường và vị trí gắn thông qua phổ tương tác 2 chiều HMBC.

Tuy nhiên, với việc sử dụng phổ NMR, chúng ta chưa khẳng định được cấu hình D/L của từng phân tử đường.

 Xác định đường D và L: Trước hết thủy phân cắt đứt mạch đường thành các đường đơn, sau đó tinh chế bằng các phương pháp sắc ký kết hợp để thu được các đường đơn. Tiến hành đo độ quay cực từng đường đơn rồi so sánh kết quả độ quay cực riêng với các dữ liệu đã công bố. Từ đó xác định được cấu hình D/L của đường.

Các bước được tiến hành cụ thể như sau: mỗi hợp chất (GS1-GS8 và GL1- GL5, 3,0 mg) được hòa tan trong 1 mL HCl 1,0 N (dioxane-H2O, 1:1, v/v) và đun nóng đến 80°C trong 3h. Hỗn hợp phản ứng sau đó được chiết với CHCl3, lớp nước tiếp tục được thổi khô bằng khí N2 cho cặn chiết nước (A). Cặn chiết A được phân tách bằng cột sắc ký silica gel rửa giải bằng CH2Cl2–MeOH (10:1, v/v), sau đó tiếp tục cho qua cột pha đảo sử dụng dung môi rửa giải MeOH–H2O với độ phân cực tăng dần (6:4, 7:3 và 8:2, v/v) thu được các đường đơn, đo độ quay cực riêng và so sánh giá trị thu được với độ quay cực riêng của các đường chuẩn đã công bố.

Kết quả như sau:

Hợp chất GS1, GS3: D-cymarose, D-oleandrose, D-thevetose

Hợp chất GS2, GS4, GS7: D-cymarose, D-oleandrose, 6-deoxy-3-O-methyl-

D-allose

Hợp chất GS5, GL1, GL2, GL3, GL4: D-cymarose, D-oleandrose, D- thevetose, D-glucose

Hợp chất GS6, GS8, GL5: D-cymarose, D-oleandrose, 6-deoxy-3-O-methyl-

D-allose, D-glucose

Bảng 2.1. Giá trị độ quay cực riêng của các đường đơn sau thủy phân

Đường đơn

[α]D thực nghiệm	[α]D tham khảo
D-cymarose (cym)	+50,1 (c 0,4, H2O)	+51,8 [69]
D-oleandrose (ole)	−12,1 (c 0,4, H2O)	−11,7 [69]
D-thevetose (thv)	+40,3 (c 0,4, H2O)	+42,3 [5]
6-deoxy-3-O-methyl-D-allose (all)	+10,9 (c 0,4, H2O)	+10,0 [70]
D-glucose (glc)	+ 49,2 (c 0,4, H2O)	+48,0 [70]

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 255 trang tài liệu này.

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -glucosidase

Nguyên tắc: Hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành đường glucose và p- nitrophenol, hợp chất có màu vàng, dưới xúc tác của enzyme α-glucosidase. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, sự tạo thành hợp chất p-nitrophenol sẽ giảm, do vậy mật độ quang (OD) của p-nitrophenol so với mẫu đối chứng, không bị

ức chế sẽ giảm theo. Mật độ quang (OD) của p-nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo ở bước sóng 405 nm và được dùng để đánh giá hoạt động ức chế enzyme của mẫu thử.

Cách tiến hành: Sử dụng phiến 96-giếng, trong mỗi giếng chứa mẫu nghiên cứu (20

L mẫu hòa tan trong DMSO), sau đó thêm enzyme α-glucosidase (40 L) và 120

L đệm phosphate buffe. Sau 5 phút thêm 40 L 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 5 mM rồi ủ trong 30 phút ở 37oC. Đo độ hấp thụ quang OD ở bước sóng 405 nm [71].

Đối chứng dương: Acarbose.

Kết quả được tính theo công thức sau:

Trong đó:

% Ức chế =

(ODc+ - ODc- ) - (ODs - ODb ) x100 ODc+ - ODc-

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử, có α-

glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%).

ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và α-

glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%). ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử.

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α-glucosidase). Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm.

Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 8.0.

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -amylase

Nguyên tắc: Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân tinh bột khoai tây trong nước với sự có mặt của enzyme α-amylase . Dung dịch tinh bột hòa tan dưới xúc tác của enzyme α-amylase tạo ra một hỗn hợp phản ứng tạo màu xanh với i ốt, đo độ giảm màu ở bước sóng 650 nm để đánh giá hoạt tính ức chế enzyme của mẫu nghiên cứu.

Cách tiến hành: Đun sôi 100 mg tinh bột khoai tây trong 5 mL đệm phosphate trong 5 phút, sau đó làm nguội về nhiệt độ phòng. Tiếp đó mẫu thử (20 µL) và tinh bột (50

µL) được trộn lẫn với 30 µL đệm phosphate 0,1 M. Sau 5 phút thêm vào 20 µL dung dịch α-amylase 5 mg/mL. Hỗn hợp phản ứng sau đó được ủ ở 37°C trong vòng 15

phút. Phản ứng kết thúc bằng việc thêm 50 µL HCl 1 M và sau đó là 50 µL dung dịch iốt. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng 650 nm và tính % ức chế [71].

- Đối chứng dương: Acarbose.

- Kết quả được tính theo công thức sau:

Trong đó:

% Ức chế =

(ODc+ - ODc- ) - (ODs - ODb ) x100 ODc+ - ODc-

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử, có α-

amylase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%);

ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và α-amylase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%);

ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử.

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α-amylase). Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm.

Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 8.0

2.3. Phân lập các hợp chất

2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài G. sylvestre

Thân và lá loài Gymnema sylvestre được thái nhỏ, phơi khô, nghiền mịn thu được 4,0 kg bột khô. Bột này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 10 L) bằng thiết bị chiết siêu âm (mỗi lần 3 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 450,0 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hòa vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate, loại bỏ dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn n-hexane (GSL1, 47,0 g), CH2Cl2 (GSL2, 60,0 g), ethyl acetate (GSL3, 87 g) và lớp nước (GSL4). Phân đoạn GSL2 được sắc ký trên cột silica gel rửa giải bằng dung môi n-hexane:acetone (40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2,5:1, 1:1, và 0:1, v:v) cho bảy phân đoạn, GS2A-GS2G. Phân đoạn GS2F được sắc ký trên cột silica gel pha thường rửa giải bằng CHCl3: MeOH (11:1, v:v) cho bốn phân đoạn nhỏ hơn, GS2F1-GS2F4. GS2F1 được sắc ký trên cột RP-18 sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH: H2O (4:1, v:v) cho năm phân đoạn, GS2F1A-GS2F1E. Các hợp chất GS1