Ảnh Hưởng Của Naa Và Ba Đến Tạo Phôi Từ Mô Sẹo Mảnh Lá (3 X 10 Mm), Ở Môi

cấy, mô sẹo hình thành trên khắp bề mặt mẫu cấy mảnh lá; không ghi nhận có sự hình thành mô sẹo ở nghiệm thức đối chứng (Hình 3.17A). Qua quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy trên bề mặt mô sẹo ở tất cả các nghiệm thức có 2,4-D đều có các cụm mô nhỏ có bề mặt khô, màu hơi trắng/vàng, xuất hiện rải rác trên bề mặt mô sẹo, đây là các cụm mô sẹo nhỏ có KNSP (không thu thập số liệu). Điểm đặc biệt các mẫu cấy ở 2 mg/L 2,4-D, ngoài sự hình thành các cụm mô sẹo nhỏ nêu trên còn ghi nhận có sự hình thành một số phôi dạng cầu có màu hơi xanh ở một số mẫu (Hình 3.17D,E). Do vậy, 2 mg/L 2,4-D được sử dụng để tạo vật liệu mô sẹo phục vụ nghiên cứu tạo phôi.

Tạo phôi

Mô sẹo hình thành từ mảnh lá (3 x 10 mm) được nuôi cấy tái sinh trên môi trường SH có sự kết hợp của NAA với các nồng độ khác nhau và 0,25 mg/L BA. Kết quả thu được, ở ngày thứ 30 sau nuôi cấy, sự tái sinh phôi rất hiệu quả, phôi xuất hiện trên tất cả các mẫu cấy mô sẹo, số lượng phôi nhiều ở môi trường có NAA từ 2 - 5 mg/L (Bảng 3.7) (Hình 3.18B,C,D,E,F).

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của NAA và BA đến tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường SH, 30 NSC.

NAA

(mg/L)

BA (mg/L)	Số mẫu mô sẹo tạo phôi	Số phôi/mẫu mô sẹo	Đặc điểm hình thái về phôi tái sinh
1	0,25	30	4,47d*	Phôi chưa có rễ, mô sẹo kém phát triển
2	0,25	30	15,10a	Một số phôi có rễ, phôi dài, nhiều phôi nhỏ đang trong quá trình phát sinh/phát triển
3	0,25	30	14,84a	Một số phôi có rễ, phôi dài, lá mầm to; mô sẹo phát triển to
4	0,25	30	9,37b	Một số phôi có rễ, lá mầm to; mô sẹo phát triển mạnh
5	0,25	30	7,80c	Một số phôi có rễ, lá mầm to; mô sẹo phát triển mạnh

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 180 trang tài liệu này.

* Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Tương tự trường hợp nuôi cấy tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá, ở thí nghiệm này, cũng đã ghi nhận được đầy đủ các dạng phát triển khác nhau của phôi như dạng cầu, dạng tim, dạng thủy lôi, dạng có lá mầm và rễ mầm (Hình 3.18G,H).

Hình 3.18. Tạo phôi gián tiếp từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) trên môi trường SH, 30 NSC.

A. Mẫu mô sẹo làm vật liệu nuôi cấy; B,C,D,E,F. Phôi tái sinh trên môi trường SH có NAA 1, 2, 3, 4, 5 mg/L (thanh ngang 5 mm); G. Sự hình thành phôi dạng cầu (C), dạng có lá mầm và rễ mầm (vị trí mũi tên); H. Phôi dạng tim (T) và dạng thủy lôi (TL) (vị trí mũi tên).

Phôi tái sinh tạo cây con hoàn chỉnh qua nuôi cấy trên môi trường đặc ½MS không bổ sung chất ĐHST (Hình 3.19F).

Trong nghiên cứu nuôi cấy mô, vật liệu LMTB cũng được sử dụng khá phổ biến với ưu điểm là khả năng phát sinh hình thái cao hơn vì có sự tương tác tốt giữa tế bào với môi trường so với các mẫu cấy có kích thước to/dày [143].

Sự phát triển tiếp tục của phôi tái sinh cũng đã được theo dõi đến giai đoạn sau nuôi cấy 60 ngày (không thu thập số liệu) (Hình 3.19). Ở cuối giai đoạn này, nhận thấy phôi phủ kín bề mặt khối mô sẹo ở môi trường có NAA 2 mg/L (Hình 3.19B). Nhìn chung, các cụm phôi hình thành đều có màu xanh rõ, ở môi trường có NAA (3

- 5 mg/L) phôi có rễ mang nhiều lông hút (Hình 3.19C,D,E).

Hình 3.19. Phôi tái sinh từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH, 60 NSC. A,B,C,D,E. Phôi phát triển trên môi trường SH có 0,25 mg/L BA và NAA (1, 2, 3, 4, 5 mg/L), thanh ngang 6 mm; F. Cây con từ phôi qua nuôi cấy ở môi trường ½MS, 20 NSC.

Auxin (hoặc kết hợp với cytokinin) thường được sử dụng để tạo mô sẹo/phôi từ LMTB. Vu Thi Hien và cộng sự (2016) đã sử dụng 2,4-D 1 mg/L kết hợp với BA 0,5 mg/L hoặc TDZ 0,1 mg/L để tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) từ nuôi cấy lát mỏng tế bào cắt ngang (t-TCL) lá cây in vitro trên môi trường MS [144]; tương tự, mô sẹo rễ cây Panax vietnamensis in vitro 3 tháng tuổi cũng đã được tạo thành công qua nuôi cấy t-TCL (dày ~ 1 mm) trên môi trường MS có 2,4-D 1 mg/L kết hợp với NAA 0,5 mg/L hoặc/và kết hợp với kinetin 0,2 mg/L [74]. Trong nghiên cứu tạo phôi từ mô sẹo t-TCL chồi in vitro 02 giống Blackberry (Rubus sanctus và Rubus hirtus), Sabooni và Shekafandeh, (2017) đã sử dụng NAA 10,84 μM và BA 8,88 μM [145]. Scherwinski-Pereira và cộng sự (2010) đã sử dụng môi trường MS có bổ sung 0 – 450 µM Picloram, 2,4-D, 3% sucrose, 500 mg/L glutamine, 0,6 µM NAA và 12,30 µM 2iP để duy trì mô sẹo có KNSP cây cọ dầu Elaeis guineensis [146].

Từ kết quả của các thí nghiệm tạo phôi gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá NGBCC ngoài vật liệu mảnh lá (10 x10 mm), thì mảnh lá kích thước nhỏ (3 x 10 mm) đã chứng tỏ là vật liệu tốt đối với nghiên cứu tạo mô sẹo có khả năng phát sinh hình thái phôi/tái sinh phôi qua các bước phát triển khác nhau.

3.2. Nhân phôi vô tính

3.2.1. Nhân phôi trên môi trường đặc

Ở 30 NSC, kết quả (Bảng 3.8, Hình 3.20) cho thấy số phôi/cụm cao ở các nghiệm thức có 2; 3; 4; và 5 mg/L NAA, lần lượt là 20,8; 22,6; 25,3 và 26,8; nhiều ở nghiệm thức 4 mg/L và 5 mg/L NAA và ít nhất ở nghiệm thức 1 mg/L NAA (16,20). Ở các nồng độ khác nhau của NAA khi kết hợp với 0,25 mg/L BA kết quả tạo phôi có khác biệt về thống kê. Kết quả này, một lần nữa chứng minh NAA, không chỉ có tác động hiệu quả đến tạo phôi trực tiếp từ mô lá mà còn có ảnh hưởng tích cực đến tạo phôi thứ cấp từ phôi sơ cấp. Nhận thấy kích thước phôi tăng với lá mầm to, số rễ và kích thước rễ tăng khi nồng độ NAA tăng. Ở nghiệm thức đối chứng (0 mg/L NAA), phôi phát triển chiều cao, không ghi nhận tạo phôi thứ cấp (Hình 3.20C).

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp, ở môi trường đặc SH, 30 NSC.

NAA

(mg/L)

BA (mg/L)	Số phôi/cụm	Hệ số nhân	Đặc điểm hình thái cụm phôi/phôi
0	0,25	3,00f*	1,00f	Phôi phát triển chiều cao, không ghi nhận hiện tượng tạo phôi thứ cấp; lá mầm phôi to, rễ ít, ngắn
1	0,25	16,20e	5,40e	Kích thước cụm phôi nhỏ; thân phôi thấp, lá mầm phôi nhỏ, rễ ít, nhỏ và ngắn
2	0,25	20,80d	6,93d	Kích thước cụm phôi to; thân phôi thấp, lá mầm phôi trung bình, rễ ít, nhỏ và ngắn
3	0,25	22,60c	7,50c	Kích thước cụm phôi to; lá mầm phôi to, rễ nhiều, to và dài
4	0,25	25,30b	8,40b	Kích thước cụm phôi rất to; thân phôi cao, lá mầm phôi to, rễ rất nhiều, to và dài
5	0,25	26,80a	8,93a	Kích thước cụm phôi rất to; thân phôi cao, lá mầm phôi rất to, rễ rất nhiều, rất to và rất dài

* Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan.

Hình 3.20. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự nhân phôi trên môi trường đặc SH, 30 NSC.

A. Đĩa phôi nuôi cấy ban đầu; B. Cụm phôi nuôi cấy ban đầu; C. Cụm phôi ĐC (không bổ sung NAA); D,E,F,G,H. Môi trường SH có bổ sung 1, 2, 3, 4, 5 mg/L NAA, (thanh ngang 1 cm); I,J,K. Vị trí phát sinh phôi thứ cấp (mũi tên) trên thân phôi; L. Vị trí phát sinh phôi thứ cấp từ rễ phôi (mũi tên). Hình chụp dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 10X (I,J,K); 20 X (L).

Tương tự trường hợp tạo mô sẹo có KNSP và tạo phôi sơ cấp từ mô sẹo, auxin (2,4-D/NAA,…) ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp với cytokinin (BA/kinetin) cũng có vai trò rất quan trọng trong kích thích sự hình thành phôi thứ cấp từ phôi sơ cấp ở nhiều loài thực vật [129]. Môi trường tạo phôi thứ cấp Castanea sativa [136], Solanum nigrum [135] thích hợp là MS có (0,1 mg/L NAA; 0,1 mg/L BA), (2 mg/L NAA và 0,5 mg/L BA), theo thứ tự. Tương tự, tổ hợp (NAA và BA) cũng được xác định là thích hợp trong một số trường hợp khác, ví dụ (2 µM NAA và 2 µM BA) dùng cho tạo phôi thứ cấp Angelica glauca Edgew [147]; môi trường SH chứa (0,5 mg/L NAA và 2 mg/L BA) rất thích hợp đối với tạo phôi thứ cấp Crocus vernus [148]. Arya và cộng sự (1993) kết luận 2,4-D, NAA, và IAA ở nồng độ 1 mg/L có

tác động rất hiệu quả đến sự hình thành phôi thứ cấp cấp 1, cấp 2 ở Panax ginseng [34]. Và ở NGBCC, NAA và BA cũng đóng vai trò quan trọng trong tạo phôi thứ cấp tương tự như ở các trường hợp trên.

3.2.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng

3.2.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp, ở môi trường lỏng SH, 30 NSC.

NAA

(mg/L)

BA (mg/L)	Số phôi thứ cấp	Đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/ cụm phôi
0	0,25	0,00e*	Không có hiện tượng tạo phôi thứ cấp; phôi sơ cấp phát triển với hình thái rễ, thân và lá mầm rõ rệt
1	0,25	15,23d	Phôi thứ cấp nhỏ, dạng nốt tròn, màu hơi xanh; cụm phôi ít rễ
2	0,25	17,30c	Phôi thứ cấp nhỏ, dạng nốt tròn/thon dài, màu hơi xanh; cụm phôi ít rễ
3	0,25	19,37a	Phôi thứ cấp to, màu hơi xanh; cụm phôi có nhiều rễ. Có hiện tượng sùi mô sẹo ở viền lá mầm phôi cấy ban đầu.
4	0,25	18,56b	Phôi thứ cấp to, màu hơi xanh; cụm phôi có nhiều rễ. Có hiện tượng sùi mô sẹo ở viền lá mầm phôi cấy ban đầu và ở rễ

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Từ kết quả trên, 04 nghiệm thức NAA (1; 2; 3; 4 mg/L) được tiếp tục sử dụng cho nghiên cứu tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng vì ở nồng độ 5 mg/L NAA, phôi có lá mầm rất to, rễ rất to và rất dài có thể gây hạn chế quá trình nhân phôi. Kết quả cho thấy số phôi thứ cấp phát sinh từ phôi sơ cấp đơn nuôi cấy trong môi trường có 1; 2; 3; 4 mg/L NAA lần lượt là 15,23; 17,30; 19,37; 18,56 (Bảng 3.9) và phôi thứ cấp hình thành ở phần thân phôi sơ cấp (Hình 3.21D,E,F,G). Ở phôi nuôi cấy trong môi trường không bổ sung NAA, không ghi nhận hiện tượng tạo phôi thứ cấp (Hình 3.21C). Tuy số phôi ở nghiệm thức 2 mg/L NAA không nhiều như ở 02 nghiệm thức 3 mg/L và 4 mg/L NAA nhưng phôi thứ cấp hình thành có dạng nốt tròn/thon dài với

số lượng khá nhiều, rễ phôi ngắn - tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu nhân phôi sau này.

Như đã nêu trên, vai trò của auxin và cytokinin là rất quan trọng đối với sự hình thành/phát triển phôi nói chung và nói riêng đối với phôi nuôi lỏng [22][149]. Môi trường lỏng MS có bổ sung 0,5 μM NAA và 5 μM BA tạo hiệu quả cao đối với sự hình thành phôi Narcissus từ nuôi cấy mô sẹo có KNSP có nguồn gốc mô bầu noãn [150]. Tương tự, môi trường lỏng MM có 2 mg/L NAA kích thích sự tạo phôi từ mô sẹo có KNSP (từ nuôi cấy mảnh lá non) và môi trường có 2 mg/L BA tạo phôi Coffea arabica với lá mầm phát triển [151].

Hình 3.21. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.

A. Bình phôi đơn thu thập dùng thí nghiệm; B. Cận cảnh phôi đơn dùng nuôi cấy; C. Cận cảnh phôi nuôi trong môi trường không bổ sung NAA (ĐC); D,E,F,G. Phôi thứ cấp hình thành ở môi trường SH có 1, 2, 3, 4 mg/L NAA.

3.2.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi

Sau 45 ngày nuôi cấy, kết quả thí nghiệm thu được ở (Bảng 3.10) cho thấy, KLP nuôi cấy là 0,3 g (0,5%) có hệ số nhân sinh khối có giá trị thấp nhất là 10,40 và KLTP thu nhận được là 3,12 g (Hình 3.22A); khi KLP nuôi cấy là 1,2 g (2%) thu được KLTP là 17,85 g có hệ số nhân sinh khối cao nhất 14,88 (Hình 3.22C); KLP thu nhận được

đạt giá trị cao nhất là 23,45 g nhưng hệ số nhân sinh khối chỉ đạt 13,03 ở trường hợp KLP nuôi cấy là 1,8 g (3%) (Hình 3.22D). Như vậy, khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu có ảnh hưởng đến sinh khối phôi thu nhận được, do liên quan đến mật độ trong bình nuôi cấy.

Trong nuôi cấy mô sinh phôi/phôi nói chung, mật độ mẫu cấy (khối lượng mẫu cấy - g hoặc số phôi)/đơn vị thể tích môi trường có vai trò quan trọng. Khi mật độ nuôi cấy cao, làm hạn chế tiếp xúc của phôi cấy với chất dinh dưỡng và oxygen của môi trường nuôi cấy, gây ra sự cạnh tranh, do đó làm giảm sự hấp thu chất dinh dưỡng và oxygen, nên ảnh hưởng không tốt đến sinh trưởng của phôi [152]. Vì vậy, xác định khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu rất quan trọng cho sự tăng trưởng sinh khối phôi. Như vậy, trong thí nghiệm này, sử dụng khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu là 1,2 g (tương ứng 2% w/v) thì sự tăng trưởng sinh khối phôi NGBCC đáp ứng sinh trưởng tốt với hệ số nhân cao nhất.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 45 NSC

KLP nuôi

cấy (g)

KLTP thu nhận (g)	Hệ số nhân sinh khối (lần)	Đặc điểm hình thái cụm phôi
0,30 (0,5%)	3,12d*	10,40d	Cụm phôi nhỏ, lá mầm to
0,60 (1%)	6,75c	11,25c	Cụm phôi to, lá mầm to
1,20 (2%)	17,85b	14,88a	Cụm phôi rất to, lá mầm nhỏ
1,80 (3%)	23,45a	13,03b	Cụm phôi rất to, lá mầm nhỏ

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Hình 3.22. Ảnh hưởng của khối lượng phôi (w/v) nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối phôi trong môi trường lỏng SH, 45 NSC.

A,B,C,D. Môi trường nuôi cấy SH có 2 mg/L NAA và 0,25 mg/L BA, với khối lượng phôi nuôi cấy 0,3 g; 0,6 g; 1,2 g; 1,8 g.