Nhân Phôi Qua Nuôi Cấy Lỏng Lắc Trong Môi Trường Sh, 30

Đã ghi nhận một số nghiên cứu về khối lượng mẫu cấy ban đầu ảnh hưởng đến hiệu quả của sự phát sinh phôi, như C. Guillou và cộng sự (2018) nghiên cứu về phát sinh phôi của Theobroma cacao khi nuôi cấy trong bình tam giác đã sử dụng 1 – 2% (w/v) mô sinh phôi PEMs (pro-embryogenic masses) là phù hợp; ngược lại, 5% gây ức chế sinh trưởng [153]. Tương tự, B.B. Misra và S. Dey (2013), khi nuôi cấy mô sinh phôi Santalum album (trong bioreactor 1,5 – 7,5 L) với khối lượng cấy ban đầu là 1 – 2% là thích hợp nhất [154]. Đối với nuôi cấy phôi chuối lá [plantain FHIA-21 AAAB)] trong bình tam giác, García-Águila và cộng sự (2016) kết luận khối lượng cấy ban đầu thích hợp là 2% (qua so sánh các khối lượng phôi nuôi cấy từ 0,7% đến 2,7%) [155].

Hình 3.23. Nhân phôi qua nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường SH, 30 – 60 NSC.

A. Cụm phôi dùng nuôi cấy; B,C. Bình nuôi phôi ở 30 NSC, 60 NSC; D,E. Phôi với các dạng phát triển và kích thước khác nhau; F. Tập hợp phôi thu được ở 60 NSC; G,

H. Các dạng phôi điển hình (PC: phôi cầu, PTL: Phôi thủy lôi, PT: Phôi tim); I. Các dạng phát triển phôi từ dạng cầu đến dạng trưởng thành; J. Phôi trưởng thành sau cấy chuyển sang môi trường đặc. Hình được chụp dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 10X (I,J), 20X (G,H).

Trong quá trình nuôi lỏng lắc, nhận thấy có hiện tượng tạo phôi thứ cấp liên tục theo chu kỳ để tạo các phôi/cụm phôi mới - phù hợp với kết quả nghiên cứu của [156][157] về sự hình thành cụm phôi theo chu kỳ (cyclic manner) từ cực rễ của phôi Piper nigrum và từ cực chồi của phôi Elaeis guineensis, theo thứ tự. Theo dõi trong thời gian dài (đến 60 ngày) cho thấy, các phôi do tác động cơ học của quá trình lắc và do tương tác với nhau đã treo vào môi trường với nhiều hình dạng (dạng cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm) và kích cỡ khác nhau (nhỏ, to, trung bình) (qua quan sát đáy bình nuôi) (Hình 3.23D,E,F,G,H).

Qua sàng lọc, tập hợp các phôi có kích thước khác nhau được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình 3.24). Sự hình thành phôi/cụm phôi với các kích cỡ và hình dạng khác nhau đã được ghi nhận trong quá trình tạo/nhân phôi trên môi trường đặc [158] và trong môi trường lỏng [22].

Hình 3.24. Sự đa dạng của kích thước phôi từ quá trình nuôi lỏng lắc trong môi trường SH.

A. Tập hợp các loại phôi có kích thước khác nhau; B,C,D. Tập hợp các phôi có kích thước nhỏ, trung bình, to, theo thứ tự.

3.2.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp

Sau 30 ngày nuôi cấy, kết quả (Bảng 3.11) cho thấy, trong 03 loại kích thước phôi, với phôi có kích thước trung bình (~ 10 mm) tạo số phôi thứ cấp cao nhất (17,84) ở 30 NSC; ở phôi nhỏ và phôi to có số phôi thứ cấp là 7,51 và 13,92. Quan sát về hình thái của phôi thứ cấp nhận thấy phôi cấy ban đầu có kích thước nhỏ (~ 7 mm, Hình 3.25A), hầu như tạo phôi có dạng cầu (Hình 3.25B,C,D,E), còn phôi cấy

có kích thước trung bình (~ 10 mm, Hình 3.25F) phôi hình thành rất đa dạng, từ dạng cầu đến dạng có lá mầm (Hình 3.25G,H,I), với phôi cấy có kích thước lớn (~ 15 mm, Hình 3.25J) phôi hình thành có dạng có lá mầm (Hình 3.25K,L,M). Điều đó chứng tỏ, sự khác nhau về kích thước phôi cấy ban đầu có ảnh hưởng đến số phôi thứ cấp hình thành và sự phát sinh hình thái phôi thứ cấp. Như vậy, ở NGBCC vật liệu sử dụng có kích thước trung bình (bước đầu có lá mầm) là thích hợp cho nhân phôi.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.

Kích thước

phôi (mm)

Số phôi thứ cấp	Đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm phôi
~ 7	7,51c*	Phôi nhỏ, thường có dạng cầu hình thành trên các bộ phận của phôi
~ 10	17,84a	Phôi to, nhiều dạng phôi khác nhau: dạng nốt tròn, dạng thon dài và dạng có lá mầm và hình thành trên các bộ phận của phôi
~ 15	13,92b	Phôi to, thường ở dạng có lá mầm, hình thành trên các bộ phận của phôi

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 180 trang tài liệu này.

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp đã được nghiên cứu trên một số đối tượng cây trồng. Phôi hợp tử Brassica oleracea (var. gongylodes) ở giai đoạn mới có lá mầm là vật liệu nuôi cấy cho tỷ lệ tạo phôi thứ cấp cao (80,7%) khi được nuôi cấy trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng [159]. Phôi vô tính giai đoạn thủy lôi của dòng cà phê Arabica Arabica (AS2K) tạo phôi thứ cấp tốt trên môi trường MS (đặc và bán rắn) có bổ sung Thidiazuron ở nồng độ 9,08 μM [160]. Corredoira và cộng sự (2015) sử dụng phôi vô tính giai đoạn có lá mầm và cụm phôi cầu và thủy lôi Eucalyptus globulus và E. saligna × E. maidenii nuôi cấy trên môi trường có 16,11 µM NAA nhằm phát triển sinh khối [161]. Tuy nhiên, đối với Malus x domestica Borkh. (cv. 'Gloster 69'), phôi vô tính kích thước to lại cho tỷ lệ tạo phôi thứ cấp cao (> 73%) khi được nuôi cấy trên môi trường có tổ hợp NAA/BAP/KIN hoặc chỉ có TDZ (10 μM) [162].

Hình 3.25. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.

A. Phôi kích thước nhỏ dùng nuôi cấy; phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi (B,C), rễ (D), lá (E) (vị trí mũi tên). F. Phôi kích thước trung bình dùng nuôi cấy; phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi (G), rễ (H), lá (I). J. Phôi kích thước to dùng nuôi cấy; phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi (K), rễ (L), lá (M).

3.2.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi

Ở 30 NSC, kết quả (Bảng 3.12) cho thấy, KLT phôi đạt giá trị cao nhất (4,67

g) và hệ số nhân phôi cũng đạt cao nhất 15,57 ở môi trường nuôi cấy SH có bổ sung 50 g/L sucrose. Nghiệm thức có nồng độ sucrose thấp (20 g/L) KLT phôi thu nhận được là thấp nhất (2,14 g) phôi có màu xanh, lá mầm to, rễ dài so với phôi trong môi trường có nồng độ sucrose cao (40 – 50 g/L) - phôi màu hơi vàng, lá mầm nhỏ, và rễ ngắn (Hình 3.26).

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.

Nồng độ

sucrose (g/L)

KLT phôi thu nhận (g)	Hệ số nhân phôi	Đặc điểm hình thái, màu sắc cụm phôi
20	2,14d*	7,29d	Cụm phôi màu xanh, phôi có lá mầm to, rễ dài
30	2,87c	9,57c	Cụm phôi màu xanh, phôi có lá mầm to, rễ dài
40	3,56b	11,87b	Cụm phôi màu hơi vàng, phôi có lá mầm nhỏ, rễ ngắn
50	4,67a	15,57a	Cụm phôi màu hơi vàng, phôi có lá mầm nhỏ, rễ ngắn

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.

A,B,C,D. Sự phát sinh phôi thứ cấp trong môi trường có nồng độ sucrose 20, 30, 40, 50 g/L

Naing và cộng sự (2013) kết luận cảm ứng tạo phôi thứ cấp Chrysanthemum cv. Euro tốt hơn trên môi trường (MS có 2 mg/L 2,4-D, 2 mg/L kinetin) có 60 g/L đường so với 30 g/L [75]. Ngược lại, phôi thứ cấp Panax ginseng phát sinh trên môi trường MS, không có chất điều hòa sinh trưởng, với nồng độ đường tương đối thấp (20 - 30 g/L); và nồng độ 20 g/L kích thích sự phát triển tiếp tục của phôi nhưng nồng độ 30 g/L gây hạn chế dù kích thích tăng sinh khối [73]. Tương tự, Al Shamari và cộng sự (2018) kết luận phôi thứ cấp Brassica oleraceae var. Botrytis phát sinh tốt từ trụ dưới lá mầm phôi sơ cấp cũng trên môi trường bán rắn MS (không bổ sung chất

điều hòa sinh trưởng) có 30 g/L đường [163]. Nhìn chung, sự phát triển sinh khối phôi NGBCC có nhu cầu về đường khá cao – tương tự một số trường hợp nêu trên.

3.2.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi

Kết quả cho thấy (Bảng 3.13, Hình 3.27), cường độ ánh sáng 2.000 - 4.000 lux đã có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng sinh khối phôi so với nuôi phôi trong điều kiện tối. Hệ số nhân phôi ở nghiệm thức tối, 2.000 lux và 4,000 lux lần lượt là 8,42; 9,37 và 10,40. Nói chung, phôi nuôi ngoài sáng xanh hơn phôi nuôi trong tối. Phôi là cấu trúc mang nhiều lục lạp nên thường được nuôi cấy trong điều kiện có chiếu sáng. Naing và cộng sự (2013) đã thực hiện nuôi cấy phôi sơ cấp Chrysanthemum cv. Euro (môi trường MS có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L kinetin) nhằm tạo phôi thứ cấp ở điều kiện chiếu sáng cao 60 - 100 µmol m-2 s-1 (~ 4.500 – 7.500 lux) (16 h sáng : 8 h tối) [75]. Sử dụng cường độ ánh sáng 80 µmol m-2 s-1 (~ 6.000 lux), 40 µmol m-2 s-1 (~ 3.000 lux) đối với nuôi cấy tạo phôi thứ cấp Brassica oleracea var. Botrytis [163], Polyscias filicifolia [54], theo thứ tự, cũng đã được ghi nhận. Ngược lại, ở tạo phôi thứ cấp Quercus robur, nuôi cấy được thực hiện trong cùng điều kiện tối [76] như nuôi cấy vật liệu phôi sơ cấp. Ở NGBCC, nuôi nhân phôi ở điều kiện ánh sáng cao đã thúc đẩy sự hình thành phôi thứ cấp dẫn đến tăng sinh khối tốt – phù hợp với tình hình chung về bố trí điều kiện sáng khi dùng vật liệu chứa nhiều lục lạp.

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.

Cường độ ánh

sáng (lux)

KLT phôi thu nhận (g)	Hệ số nhân phôi	Đặc điểm hình thái, màu sắc phôi
0 (tối)	2,53c*	8,42c	Phôi màu hơi vàng, lá mầm nhỏ, rễ phôi nhiều, dài
2.000	2,81b	9,37b	Phôi màu xanh, lá mầm to, rễ phôi trung bình
4.000	3,12a	10,40a	Phôi màu xanh, lá mầm to, rễ phôi ít, ngắn

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Hình 3.27. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC

A. Phôi nuôi trong tối (ĐC); B,C. Phôi nuôi ngoài sáng cường độ 2.000 lux, 4.000 lux; D,E. Cận cảnh phôi nuôi trong tối, ánh sáng 4.000 lux.

3.2.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp

Ở 21 NSC, kết quả cho thấy nước dừa đã ảnh hưởng tích cực đến quá trình hình thành và phát triển phôi thứ cấp. Ở nghiệm thức 10% nước dừa, số phôi trung bình đạt giá trị cao nhất (17,20) so với nghiệm thức không bổ sung nước dừa (13,40); ngoài ra, cũng ghi nhận được lá mầm to và rễ dài (Bảng 3.14, Hình 3.28). Nước dừa chứa nhiều thành phần dinh dưỡng tự nhiên như đường, vitamin, muối khoáng, acid amin, các chất điều hòa sinh trưởng [164]. Vì vậy, bổ sung 10% nước dừa vào môi trường nhân phôi ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh và phát triển phôi thứ cấp.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp, trong môi trường lỏng SH, 21 NSC.

Nước

dừa (%)

Số phôi thứ cấp	Đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm phôi
0	13,40c*	Cụm phôi nhỏ, lá mầm phôi nhỏ, ngắn; rễ phôi ít, ngắn
5	14,27b	Cụm phôi trung bình, lá mầm phôi trung bình; rễ phôi nhiều, dài
10	17,20a	Cụm phôi to, lá mầm phôi to, dài; rễ phôi nhiều, dài

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Hình 3.28. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp, trong môi trường lỏng SH, 21 NSC.

A. Bình vật liệu phôi nuôi cấy. B,C,D. Phôi nuôi trong môi trường SH có nước dừa 0%, 5%, 10%.

Qua nuôi cấy mô sẹo có KNSP mang phôi sơ cấp (từ mô hoa đực non chuối Musa spp. AAB cv. Dwarf Brazilian) trên môi trường MS chỉ có 10% nước dừa, kết quả cho thấy có sự hình thành phôi thứ cấp với tỷ lệ 39,8%, ở các nghiệm thức không có nước dừa đều không có sự hình thành phôi thứ cấp [165]. Nước dừa (2 – 10%) có ảnh hưởng tích cực đến cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo có KNSP (từ nuôi cấy mảnh lá) Kalopanax septemlobus [166]; nước dừa ngoài làm tăng sự phát sinh phôi từ mô sẹo (ở nồng độ 20%), còn làm tăng sự tạo chồi từ phôi trưởng thành (ở nồng độ 10%) đối với chà là Phoenix dactylifera [77]. Trong tạo phôi Phoenix dactylifera, nước dừa (10

– 15%) có tác động rất quan trọng [167]. Đối với loài Schefflera leucantha cùng chi Ngũ gia bì, với tỷ lệ nước dừa 15% đã ảnh hưởng rất tốt đến chiều cao chồi, số lá, số đốt thân,.. [168]. Như vậy, ở NGBCC nước dừa cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển phôi thứ cấp, với tỷ lệ thích hợp là 10%.

3.2.2.7. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc

Các phôi đơn (Hình 3.29A) được nuôi cấy trong môi trường lỏng MS hoặc

½MS (không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, 20 g/L sucrose) nhằm thử nghiệm tạo cây con. Kết quả cho thấy, tương tự như tạo cây đối với phôi nuôi trên môi trường đặc, phôi phát triển trong môi trường khoáng lỏng ½MS tốt hơn so với môi trường MS ở các chỉ tiêu tạo rễ, tạo lá (Hình 3.29B,C,D,E) (không thu thập số liệu). Ở 14 NSC, các phôi được cấy chuyển sang môi trường đặc ½MS để tạo chồi và phát triển thành cây con (Hình 3.29F,G,H,I ). Các cây (đã có lá thật) sau đó được trồng ra chậu đất ở vườn ươm (Hình 3.29J,K,L).