Hình Thái Phôi Vô Tính Cây Sâm Ngọc Linh Ở Đối Chứng Và 1,6 Mg/l Agnps

Hình 3.7. Hình thái phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh ở đối chứng và 1,6 mg/L AgNPs

a: phôi vô tính từ môi trường không bổ sung AgNPs (đối chứng) sau 8 tuần nuôi cấy; b, c, d: phôi vô tính từ môi trường bổ sung 1,6 mg/L AgNPs sau 8 tuần nuôi cấy. Độ phóng đại: 10

Về lý thuyết, mỗi tế bào thực vật sống đều có khả năng phát sinh phôi vô tính. Công dụng của AgNO3 trong việc nâng cao tần suất phát sinh phôi vô tính đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau như cà phê (Coffea canephora) [61], carrot (Daucus carota) [120], vân sam trắng (Picea glauca) [89]. Trong nghiên cứu này, AgNPs lần đầu tiên được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh. Kết quả cho thấy, AgNPs đã có hiệu quả tích cực trong hình thành và phát triển phôi vô tính. Trong các nghiên cứu trước đây, sự hình thành phôi vô tính là không đáng kể khi nuôi cấy các lớp mỏng tế bào củ cây sâm Ngọc Linh dưới ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật [117]. Năm 2012, Nhựt và cộng sự đã báo cáo rằng việc bổ sung thêm spermidine vào môi trường nuôi cấy đã tạo ra hiệu quả cao trong quá trình tạo phôi thông qua mô sẹo có nguồn gốc từ

nuôi cấy lớp mỏng tế bào củ cây sâm Ngọc Linh, nhưng chủ yếu là các dạng phôi hình cầu, kết dính [119]. Trong nghiên cứu này, AgNPs ở nồng độ tối ưu có tác động tích cực đến sự hình thành phôi vô tính cũng như tăng sinh từ mô sẹo cây sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ mẫu lá ex vitro. Đặc biệt, những phôi này có sự đa dạng về hình thái cũng như chúng chuyển sang trạng thái biệt hóa với bề mặt trơn láng, dần dần hình thành phát thể 2 lá mầm, thích hợp cho việc hình thành cây con chất lượng cao. Kết quả này cũng cho thấy rằng có một sự khác biệt đáng kể so với nghiên cứu của Nhựt và cộng sự (2011) khi sử dụng mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu lá ex vitro để tái sinh chồi (8,2 chồi/mẫu) và hình thành cây con không thông qua quá trình phát sinh phôi vô tính [117]. Cho đến nay vẫn chưa có báo cáo cho thấy cơ chế của AgNPs ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi vô tính. Tuy nhiên, có các nghiên cứu chứng minh AgNO3 như một chất ức chế sinh tổng hợp của khí ethylene [39] và sử dụng tiền chất SAM cho các phản ứng polyamine ảnh hưởng đến phát sinh phôi vô tính [89]. Trong nghiên cứu này, sự hình thành phôi vô tính được quan sát dưới ảnh hưởng của AgNPs có thể cung cấp bằng chứng cho lý thuyết mới rằng AgNPs thúc đẩy sự hình thành và tăng sinh phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh thông qua điều hòa hoạt động của khí ethylene.

Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi tương tự như nghiên cứu của Aghdaei và cộng sự (2012) đã cho rằng AgNPs rất có tiềm năng trong quá trình tạo chồi trên cây chùm ớt (Tecomella undulata). Kết quả cho thấy tác động tích cực của AgNPs lên tỷ lệ tái sinh chồi, số lượng chồi, chiều cao chồi khi được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 10 mg/L đến 80 mg/L AgNPs. Nhưng nếu trong môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng thì sau một vài ngày các mô sẹo và chồi này chuyển sang màu nâu và chết dần [23]. Sharma và cộng sự (2012) đã báo cáo rằng sử dụng AgNPs ở nồng độ 50 mg/L bổ sung vào môi trường MS đã cải thiện các đặc tính tăng trưởng (chiều dài chồi, chiều dài rễ, khối lượng tươi) của cây cải (Brassica juncea) bằng cách giảm hàm lượng hydro peroxide, malondialdehyd và proline thông qua kích hoạt các enzyme chống oxy hóa. Tuy nhiên, nồng độ AgNPs cao hơn (100 – 400 mg/L) có tác động bất lợi đến sự tăng trưởng của cây con [142]. Sarmast và cộng sự (2015) đã nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình biểu hiện gene của cây chùm ớt

(Tecomella undulata). Kết quả cho thấy những tác động tích cực của AgNPs đối với sự gia tăng tỷ lệ cảm ứng tạo chồi; số lượng chồi, chiều cao chồi được tạo ra đã tăng đáng kể khi các mắt ngủ của cây này được cấy trên môi trường MS có bổ sung 60 mg/L AgNPs kết hợp với 2,5 mg/L BAP và 0,1 mg/L IAA. Tuy nhiên, ở nồng độ cao hơn (trên 60 mg/L), tác động bất lợi đối với tái sinh chồi là rõ ràng [136]. Bernard và cộng sự (2015) đã kiểm tra tác dụng của các hạt AgNPs (0; 1; 2,5; 5 mg/l) lên hiện tượng thủy tinh thể của cây trong vi nhân giống cỏ xạ hương (Thymus daenensis). Kết quả cho thấy sau 3 tuần gieo hạt trên môi trường thạch bổ sung 2,5 mg/L AgNPs sẽ hình thành các chồi có đốt thân dài, lá phát triển bình thường, trong khi đó, các nghiệm thức nồng độ cao 5 mg/L lại cho chồi phát triển chậm, chồi thấp và lá xoăn, biến dạng. Đặc biệt, sự thay đổi hàm lượng các loại polyamine khác nhau đã được ghi nhận. Kết quả cho thấy, khi sử dụng 2,5 mg/l AgNPs, hàm lượng các polyamine như putrescine, spermine gia tăng mạnh. Các polyamine này có vai trò kích thích sự phân chia tế bào, hình thành các cơ quan tương tự như các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Trong khi đó, sự tổng hợp các polyamine và ethylene đều thông qua một tiền chất chung là S-adenosyl-L-methionine - là một tiền chất để tạo thành ethylene [177]. Polyamine và ethylene có hiệu quả đối kháng trong quá trình già lá và chín quả. Khi thực vật gia tăng tổng hợp polyamine, nó sẽ cạnh tranh tiền chất SAM với ethylene từ đó làm giảm hiện tượng thủy tinh thể của cây nuôi cấy in vitro[37]. Các kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của chúng tôi rằng AgNPs được chứng minh là chất thúc đẩy quá trình tạo chồi cây salem diễn ra nhanh với số lượng và chất lượng cao hơn có thể là do ảnh hưởng của các polyamine thông qua ức chế sinh tổng hợp của khí ethylene. Chất điều hoà sinh trưởng chỉ có vai trò quan trọng trong sự cảm ứng tạo chồi ban đầu.

Tóm lại, môi trường nuôi cấy có bổ sung AgNPs nồng độ 1,6 mg/L là tối ưu nhất cho sự phát sinh phôi cũng như hình thái phôi và tỷ lệ này giảm dần khi tăng hoặc giảm nồng độ AgNPs. Đặc biệt, hiện tượng thuỷ tinh thể chồi cây salem và sâm Ngọc Linh giảm đáng kể ở nồng độ AgNPs thích hợp.

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA AgNPs VÀ FeNPs LÊN QUÁ TRÌNH TẠO CÂY CON HOÀN CHỈNH TỪ CHỒI NUÔI CẤY IN VITRO

3.3.1. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem nuôi cấy in vitro

Tạo được cây hoàn chỉnh, có chất lượng tốt trong nuôi cấy in vitro là việc rất quan trọng quyết định khả năng sống sót, sinh trưởng và phát triển ở các giai đoạn vườn ươm. Việc bổ sung AgNPs hay thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem sau 4 tuần nuôi cấy in vitro (Bảng 3.6, Hình 3.8).

Kết quả cho thấy rễ được hình thành trên môi trường có bổ sung AgNPs sau 5 ngày nuôi cấy và môi trường thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs cho sự hình thành rễ sau 7 ngày nuôi cấy; trong khi đó, môi trường không bổ sung AgNPs và không thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs (đối chứng) là sau 14 ngày. Tỷ lệ ra rễ là 100% ở tất cả các nồng độ AgNPs được bổ sung, FeNPs được thay thế và đối chứng sau 4 tuần nuôi cấy. Ngoài ra môi trường bổ sung AgNPs cho bộ rễ phát triển mạnh hơn so với môi trường thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs và đối chứng (Hình 3.8). Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây như chiều cao cây (8,43 cm), khối lượng tươi (2,36 g), khối lượng khô (108,17 mg) và giá trị chlorophyll (26,90 nmol/cm2) ở 0,4 mg/L AgNPs đạt tối ưu so với đối chứng, các AgNPs khác và FeNPs (lần lượt là 5,36 – 6,56 cm; 0,81 – 1,77 g; 63,58 – 95,91 mg; 16,50 – 22,36 nmol/cm2). Đặc biệt, chiều rộng lá đạt rất cao (0,93 – 1,20 cm) nhưng chỉ số chlorophyll lại rất thấp (16,5 – 21,40 nmol/cm2) ở nồng độ 0,8 – 2,0 mg/L AgNPs. Điều này cho thấy ở nồng độ AgNPs càng cao sẽ kích thích bộ lá phát triển theo chiều ngang nhưng đồng thời cũng làm giảm hàm lượng chlorophyll trong lá. Chiều dài rễ ở 0,8 mg/L AgNPs (1,03 cm) có cao hơn nhưng không đáng kể so với 0,4 mg/L AgNPs (1,96 cm) và không có sự khác biệt trong thống kê. Thêm vào đó, rễ ở nghiệm thức 0,8 mg/L AgNPs giòn, dễ bị đứt gãy khi có tác động cơ học, không đồng đều (Hình 3.8a3, b3). Ở 2,8 mg/L FeNPs cho thấy các chỉ tiêu theo dõi tương tự so đối chứng và cao hơn không đáng kể so với các nồng độ FeNPs còn lại.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem sau 4 tuần nuôi cấy

Nano (mg/L) Tỷ lệ ra rễ

Chiều cao

Chiều rộng

Chiều dài

Khối lượng

Chlorophyll

AgNPs

FeNPs	(%)	cây (cm)	lá (cm)	rễ (cm)	tươi (g)	khô (mg)	(nmol/cm2)
0,0	0,0	100,00a*	6,36b	0,56b	0,66b	1,74b	94,87b	22,36b
0,4	-	100,00a	8,43a	0,56b	0,96a	2,36a	108,17a	26,90a
0,8	-	100,00a	6,56b	0,93a	1,03a	1,24c	80,58c	21,40bc
1,2	-	100,00a	5,33de	1,03a	0,56bcd	1,02cde	76,22c	18,86bcd
1,6	-	100,00a	5,16e	1,16a	0,40cd	0,86de	75,51c	18,20cd
2,0	-	100,00a	5,10e	1,20a	0,50bcd	0,81e	63,58d	16,50d
-	0,7	100,00a	5,00e	0,36b	0,43bcd	1,28c	75,95c	18,90bcd
-	1,4	100,00a	5,36cde	0,36b	0,53bcd	1,30c	76,70c	19,49bcd
-	2,8	100,00a	6,20bc	0,56b	0,63bc	1,77b	95,91b	21,23bc
-	5,6	100,00a	6,10bcd	0,53b	0,43bcd	1,20cd	80,77c	20,76bc
-	8,4	100,00a	5,40cde	0,53b	0,40cd	1,31c	79,77c	19,77bcd
-	11,2	100,00a	5,36cde	0,50b	0,36d	1,31c	79,17c	19,13bcd

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 195 trang tài liệu này.

Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức = 0,05 trong phép thử Duncan.

Hình 3.8. Cây salem sinh trưởng và phát triển trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs ở các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy

a1, b1: cây trên môi trường không bổ sung AgNPs; a2, b2: cây trên môi trường bổ sung 0,4 mg/L AgNPs; a3, b3: cây trên môi trường bổ sung 0,8 mg/L AgNPs; a4, b4: cây trên môi trường bổ sung 1,2 mg/L AgNPs; a5, b5: cây trên môi trường bổ sung 1,6 mg/L AgNPs; a6, b6: cây trên môi trường bổ sung 2,0 mg/L AgNPs; c1, d1: cây trên môi trường không thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs; c2, d2: cây trên môi trường thay thế Fe-EDTA bằng 0,7 mg/L FeNPs; c3, d3: cây trên môi trường thay thế Fe-EDTA bằng 1,4 mg/L FeNPs; c4, d4: cây trên môi trường thay thế Fe-EDTA bằng 2,8 mg/L FeNPs; c5, d5: cây trên môi trường thay thế Fe-EDTA bằng 5,6 mg/L FeNPs; c6, d6: cây trên môi trường thay thế Fe-EDTA bằng 8,4 mg/L FeNPs; c7, d7: cây trên môi trường thay thế Fe-EDTA bằng 11,2 mg/L FeNPs sau 4 tuần nuôi cấy.

Ngoài ra, hình thái lá thay đổi tuỳ thuộc vào nồng độ AgNPs được bổ sung và FeNPs được thay thế trong môi trường nuôi cấy. Kết quả ghi nhận cho thấy hình thái lá to, ngắn, yếu, giòn, dễ gãy, có hiện tượng hoá nâu ở gốc dẫn đến thối gốc, vàng lá, hình thái cây có hiện tượng bất thường (Hình 3.8a3, b3, a4, b4, a5, b5, a6, b6) trên môi trường bổ sung 0,8 – 2,0 mg/L AgNPs. Bên cạnh đó, lá nhỏ, dài, có răng cưa và xoăn được ghi nhận trên môi trường thay thế Fe-EDTA bằng 0,7; 1,4; 8,4 – 11,2 mg/L FeNPs. Đặc biệt, lá cây phát triển nhanh, dài, rộng, màu xanh đậm ở môi trường có bổ sung 0,4 mg/L AgNPs (Hình 3.8a2, b2) so với đối chứng và 2,8 mg/L FeNPs cho thấy chiều rộng lá nhỏ, có nhiều răng cưa, lá xanh nhạt (Hình 3.8a1, b1, c4, d4)

Như vậy, việc bổ sung 0,4 mg/L AgNPs vào môi trường nuôi cấy là tối ưu cho quá trình tạo cây hoàn chỉnh trong vi nhân giống cây salem

3.3.2. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây nuôi cấy in vitro

Kết quả quan sát cho thấy các chồi cây dâu tây ở các nồng độ AgNPs và FeNPs đã có dấu hiệu ra rễ sau tuần đầu tiên so với đối chứng (không bổ sung AgNPs và không thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs) là ở tuần thứ hai.

Tỷ lệ ra rễ đạt tối ưu ở 0,5 mg/L AgNPs và 1,4 mg/L FeNPs (78,89 – 88,89%) so với đối chứng (71,11%) sau 4 tuần nuôi cấy. Số rễ (4,00), khối lượng tươi (0,75 g), khối lượng khô (84,19 mg) và chỉ số chlorophyll (38,31 nmol/cm2) ở nồng độ 1,4 mg/L FeNPs tương đồng so với 0,5 mg/L AgNPs (lần lượt là 5,00; 0,46 g; 80,61 mg; 34,49 nmol/cm2) và cao hơn so với đối chứng (lần lượt là 2,66; 0,30 g; 40,10 mg; 27,40 nmol/cm2) (Bảng 3.7). Kết quả cũng ghi nhận chiều cao cây (4,72 – 6,75 cm), chiều dài rễ (5,13 – 4,46 cm) ở 1,0 – 1,5 mg/L AgNPs cao hơn so với 0,5 mg/L AgNPs (lần lượt là 3,96 cm; 3,10 cm) và ngang bằng với 0,7 – 2,8 mg/L FeNPs (lần lượt là 5,36 – 5,56 cm; 3,16 – 3,60 cm); nhưng ở các nồng độ AgNPs cho các thân nhỏ, lá nhỏ, mỏng có màu xanh nhạt, rễ giòn, dễ bị đứt gãy khi có tác động, không đồng đều so với các cây ở các nồng độ FeNPs có thân to, lá rộng, dày, có màu xanh đậm, rễ đồng đều phát triển mạnh. Đặc biệt, ở 1,4 mg/L FeNPs cho cây con phát triển vượt trội hơn so với các nghiệm thức còn lại (Hình 3.9).

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây sau 4 tuần nuôi cấy

AgNPs	FeNPs	(%)	cây (cm)		rễ (cm)	tươi (g)	khô (mg)	(nmol/cm2)
0,0	0,0	71,11bc*	3,96b	2,66bcd	3,10ab	0,30bcd	40,10d	27,40c
0,5	-	78,89ab	4,63b	5,00ab	1,60bc	0,46b	80,61ab	34,49ab
1,0	-	65,55bcd	6,75a	4,00abc	5,13a	0,71a	65,19c	30,31bc
1,5	-	58,89cd	4,72ab	4,33abc	4,46a	0,44b	73,35bc	29,98bc
2,0	-	52,22d	3,49b	6,33a	0,96c	0,26cd	38,98de	28,44bc
-	0,7	56,67cd	5,56ab	2,00cd	3,60ab	0,32bcd	72,68bc	25,32cd
-	1,4	88,89a	6,76a	4,00abc	4,46a	0,75a	84,19a	38,31a
-	2,8	61,11cd	5,36ab	2,66bcd	3,16ab	0,37bc	76,61ab	29,16bc
-	5,6	51,11d	4,10b	2,33cd	1,96bc	0,19d	37,98de	24,11cd
-	11,2	32,22e	3,60b	0,66d	1,93bc	0,18d	30,13e	20,57d

Nano (mg/L) Tỷ lệ ra rễ

Chiều cao

Số rễ Chiều dài

Khối lượng

Chlrophyll

Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức = 0,05 trong phép thử Duncan.