Hoạt Tính Enzyme Của Chủng Aspergillus Niger Ga15 Khi Lên Men Xốp Ở Các Thời Gian

lên men xốp với cơ chất cám mì, ở nhiệt độ phòng trong bốn ngày, hoạt tính của amylase cao nhất ở pH5,5 với hoạt tính là 13 U/mg. Gupta & cs. (2008) cho biết chủng A.niger sản xuất amylase cao ở pH5.

Trái ngược với các kết quả này, Varalakshmi & cs. (2009) báo cáo hoạt động của amylase tối đa là 75 U/g protein ở pH9,5. Costa (1998) cho rằng pH tối ưu là 4,6 để sản xuất amyloglucosidase khi lên men xốp chủng A. niger NRRL 3122 trong môi trường cám gạo.

4.1.5.5. Thời gian

Tối ưu thời gian lên men là một thông số quan trọng cho sự phát triển tối đa của các chủng vi sinh vật, từ đó ảnh hưởng lớn đến quá trình sản sinh enzyme. Để lựa chọn thời gian tối ưu cho lên men sản xuất đa enzyme (glucoamylase, α- amylase và cellulase) của chủng đột biến Aspergillus niger GA15, tiến hành lên men ở cơ chất cám mì, độ ẩm 50%, pH5,5 ở 30oC trong thời gian từ 2 đến 8 ngày.

Kết quả cho thấy, lượng glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 sản sinh ra tăng dần sau các ngày lên men, sản lượng tối đa đạt được ở ngày lên men thứ 5 với hoạt tính của 3 enzyme lần lượt là: 42,09; 56,5 và 26,4 (U/g), cao gấp 5,3; 6,1 và 4,7 lần so với ngày lên men thứ 2. Sau 5 ngày lên men, hoạt tính của các enzyme giảm dần, ở ngày thứ 8, hoạt tính của glucoamylase, α-amylase và cellulase còn lại tương ứng là 11,42; 22,43 và 10,18 (U/g) (Bảng 4.7, Hình 4.8).

Bảng 4.7. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi lên men xốp ở các thời gian khác nhau

Thời gian lên men (ngày)

Hoạt tính enzyme (U/g), n=3
Glucoamylase (Mean ± SE)	α-amylase (Mean ± SE)	Celullase (Mean ± SE)
2	7,88d ± 1,35	9,26d ±2,07	5,63e ± 0,27
3	23,90bc ± 1,96	31,35bc ±2,29	13,00d ± 0,72
4	41,11a ± 2,25	55,07a ± 1,78	22,40b ± 0,78
5	42,09a ± 1,33	56,50a ± 0,43	26,40a ± 1,06
6	26,77b ± 1,50	35,35b ± 1,63	18,05c ± 1,14
7	25,36bc ± 1,52	33,38b ± 1,49	13,15d ± 0,80
8	17,42c ± 1,94	22,43c ± 2,57	10,18d ± 0,71

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 197 trang tài liệu này.

Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05)

Hình 4.8. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

Khả năng sản xuất enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 giảm đi trong giai đoạn sau của sự tăng trưởng có thể liên quan đến việc ức chế quá trình dị hóa do việc giải phóng đường glucose từ sự thủy phân tinh bột, dẫn tới giảm sự sản xuất enzyme vì những đường này là nguồn carbon dễ sử dụng hơn tinh bột, thêm vào đó là sự cạn kiệt chất dinh dưỡng trong môi trường lên men (Kumari & cs., 2012). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Gupta & cs. (2008), cho biết chủng A.niger sản sinh enzyme amylase tối đa sau 5 ngày lên men xốp ở 30oC. Trong nghiên cứu của Bhavya (2007) phát hiện thời gian lên men tốt nhất cho sản xuất amylase bởi các loài Aspergillus khi lên men xốp là 6 ngày cho hoạt tính enzyme là 7 U/mg.

4.1.5.6. Tuổi giống

Thí nghiệm nhằm mục đích xác định thời gian của giống khởi động qua lên men lỏng để thu nhận giống cho khả năng lên men sinh tổng hợp đa enzyme glucoamylase, α-amylase và cellulase cao nhất. Giống khởi động ở 1, 2, 3, 4, 5 ngày tuổi được bổ sung với tỷ lệ 10% vào môi trường lên men xốp có cơ chất là cám mì, độ ẩm 50%, pH 5,5, lên men ở 30oC trong thời gian 5 ngày.

Bảng 4.8. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi lên men với các tuổi giống khác nhau

Tuổi giống (ngày)

Hoạt tính enzyme (U/g), n=3
Glucoamylase (Mean ± SE)	α-amylase (Mean ± SE)	Celullase (Mean ± SE)
1	19,03c ± 0,79	27,37c ± 1,12	7,91c ± 0,99
2	40,14a ± 1,48	57,53a ± 2,12	26,78a ± 0,28
3	39,25a ± 1,65	56,26a ± 2,36	25,38a ± 0,87
4	32,12b ± 1,43	46,07b ± 2,05	17,74b ± 0,75
5	20,65c ± 0,88	29,69c ± 1,26	14,25d ± 1,90

Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05)

Hình 4.9. Ảnh hưởng của tuổi giống đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính của glucoamylase, α-amylase và cellulase thấp nhất ở tuổi giống 1 ngày tuổi, hoạt tính cao hơn ở tuổi giống 2, 3 ngày, sau đó hoạt tính enzyme giảm dần ở tuổi giống 4 và 5 ngày. Hoạt tính enzyme thu được đạt cực đại khi sử dụng giống 2 và 3 ngày tuổi. Sau khi lên men xốp, nấm sinh trưởng và phát triển tốt nhất, sinh tổng hợp đa enzyme α-glucoamylase, α- amylase và cellulase có hoạt tính cao (Bảng 4.8, Hình 4.9)

Với giống 1 ngày tuổi khi cấy vào môi trường xốp, nấm sợi sinh trưởng và phát triển kém, cho hoạt tính enzyme thấp vì ở tuổi giống này, nấm mới bắt đầu

sinh trưởng, lượng bào tử sinh ra chưa nhiều. Đối với giống 4 và 5 tuổi ngày, nấm chuyển sang giai đoạn sợi, bào tử ít dần do đó lượng enzyme sinh ra ít hơn.

4.1.5.7. Nguồn Carbon

Thành phần của môi trường có vai trò quan trọng trong việc sản xuất enzyme. Sự sinh trưởng và sản xuất enzyme của nhiều vi sinh vật đều bị ảnh hưởng bởi cả điều kiện môi trường và thành phần dinh dưỡng của môi trường sinh trưởng (Singh & cs., 2011). Carbon là một trong những thành phần chính trong môi trường cho hoạt động trao đổi chất của sinh vật. Các nguồn carbon bổ sung khác nhau được kiểm tra ảnh hưởng của chúng trong sản xuất glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus GA15.

Bảng 4.9. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi bổ sung các nguồn carbon khác nhau vào môi trường lên men xốp

Hoạt tính enzyme (U/g), n=3

Nguồn carbon	Glucoamylase (Mean ± SE)	α-amylase (Mean ± SE)	Celullase (Mean ± SE)
Fructose	41,56a ± 1,65	64,68a ± 2,35	32,84b ± 0,34
Glucose	46,84a ± 2,20	67,94a ± 3,14	35,90a ± 1,04
Maltose	40,23a ± 1,78	62,78a ± 2,54	30,84b ±1,66
Sucrose	41,90a ± 1,19	60,87a ± 1,70	30,78b ± 0,44
Tinh bột	44,78a ± 1,02	65,00a ± 1,45	32,17b ± 1,21

Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05)

Hình 4.10. Ảnh hưởng của nguồn carbon bổ sung đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

Kết quả cho thấy, khi bổ sung 1% các nguồn carbon khác nhau vào môi trường lên men xốp, hoạt tính của 3 enzyme đều tăng so với khi không bổ sung carbon. Với các nguồn carbon khác nhau, hoạt tính của glucoamylase, α-amylase không có sự sai khác (p > 0,05), còn hoạt tính của cellulase cao nhất với 35,9 (U/g) trên môi trường bổ sung glucose (Bảng 4.9, Hình 4.10). Điều này cho thấy glucose là nguồn carbon bổ sung có ảnh hưởng tích cực đến sản xuất cellulase từ chủng nấm đột biến Aspergillus niger GA15.

Theo Alva & cs. (2007) việc sản xuất amylase tối đa đạt được khi sử dụng glucose là nguồn carbon đối với chủng Aspergillus trong lên men xốp và với hoạt tính 12,2 U/mg. Tương tự, Varalakshmi & cs. (2009) cũng báo cáo rằng sản lượng tối đa của amylase đạt được từ Aspergillus spp. JGI 12 khi glucose là chất bổ sung carbon trong môi trường lên men.

Như vậy, đối với chủng Aspergillus niger GA15, nguồn carbon thích hợp nhất cho sản sinh đa enzyme glucoamylase, α-amylase và cellulase là glucose, với hoạt tính tương ứng là 46,84; 67,94; 35,9 (U/g).

4.1.5.8. Nguồn Nitơ

Nitơ là nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Việc lựa chọn nguồn nitơ rẻ tiền và thích hợp cho lên men xốp chủng nấm sợi Aspergillus niger GA15 để sản xuất cao đa enzyme glucoamylase, α-amylase và cellulase là rất cần thiết. Các nguồn nitơ khác nhau (nitơ hữu cơ và vô cơ) đã được lựa chọn để nghiên cứu.

Bảng 4.10. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường lên men xốp

Hoạt tính enzyme (U/g), n=3

Nguồn nitơ	Glucoamylase (Mean ± SE)	α-amylase (Mean ± SE)	Celullase (Mean ± SE)
NH4Cl	48,06 ± 0,31	69,68ab ± 0,44	31,50b ± 1,07
NH4NO3	48,06 ± 1,30	69,68ab ± 1,86	31,34b ± 0,49
(NH4)2SO4	47,39 ± 0,34	68,73b ± 0,48	32,06b ± 1,43
Cao nấm men	49,73 ± 1,73	72,06ab ± 2.48	32,95b ± 1,00
Peptone	47,40 ± 1,64	73,02ab ± 2,34	34,89b ± 0,47
Ure	50,00 ± 0,78	76,75a ± 1,11	40,11a ± 0,73

Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05)

Kết quả cho thấy, khi bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường lên men xốp của chủng nấm sợi Aspergillus niger GA15, hoạt tính của các enzyme tăng

so với không bổ sung và sai khác rõ rệt khi bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường lên men xốp. Hoạt tính của cellulase đạt cao nhất khi bổ sung ure với 40,11 (U/g), các nguồn nitơ khác không thấy sự sai khác về hoạt độ của enzyme này. Hoạt tính của glucoamylase đạt cao nhất là 50 (U/g) khi môi trường lên men xốp có bổ sung thêm ure, tuy nhiên không sai khác đáng kể so với khi bổ sung các nguồn nitơ khác (P>0,05). Hoạt tính của α-amylase tương đương nhau khi bổ sung ure, peptone, cao nấm men, NH4NO3 và NH4Cl (Bảng 4.10, Hình 4.11).

Như vậy, có thể lựa chọn ure là nguồn bổ sung nitơ thích hợp nhất vào môi trường lên men xốp cho sự sản sinh của cả 3 loại enzyme glucoamylase, α-amylase và cellulase từ chủng đột biến Aspergillus niger GA15.

Hình 4.11. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

Hàm lượng nitơ trong các nguồn nitơ bổ sung là khác nhau, trong đó ure có hàm lượng nitơ cao nhất với 46,67%. Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng, nguồn nitơ đã làm tăng đáng kể năng suất của enzym được tạo ra và nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+, chúng xâm nhập vào tế bào dễ dàng và tạo nên các nhóm amine. Ure là nguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lý, khi bị phân giải bởi enzyme ure nó sẽ giải phóng thành NH3 và CO2. NH3 được vi sinh vật sử dụng mà không làm chua môi trường như các muối amon. Theo Suganthi & cs. (2011), sự sản sinh enzyme amylase tăng đáng kể khi môi trường lên men xốp được bổ sung amoni nitrat và amoni clorua. Pandey (1999) cho biết việc bổ sung các nguồn nitơ (hữu cơ hoặc vô cơ) đã làm tăng sản lượng enzyme

amylse trong lên men xốp các chủng nấm sợi. Các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng, peptone, natri nitrat và casein thủy phân là những nguồn bổ sung nitơ tốt để sản xuất amylase ở A. fumigatus, A.niger và A. oryzae (Pandey & cs., 1992).

Tổng hợp các kết quả trên, có thể xác định điều kiện lên men xốp thích hợp đối với chủng Aspergillus niger GA15 là: cơ chất cám mì, độ ẩm 50%, pH 5,5, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 5 ngày, giống 2 ngày tuổi, nguồn carbon bổ sung là glucose (1%), nguồn nitơ bổ sung là ure (1%), với hoạt tính của α- amylase, glucoamylase và cellulase đạt lần lượt là 76,75; 50 và 40,11 (U/g), hoạt tính này cao gấp 2,8; 1,29 và 3,3 lần so với lên men ở điều kiện chưa tối ưu.

4.2. XỬ LÝ BÃ SẮN THÀNH THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI

4.2.1. Thành phần hóa học của bã sắn tươi

Bã thải tinh bột sắn là bã thải xơ để lại sau khi chiết xuất tinh bột từ củ sắn trong quá trình chế biến tinh bột sắn của các nhà máy. Phân tích thành phần hóa học của bã sẵn thu được trong các cơ sở chế biến tinh bột sắn ở Hoài Đức cho thấy: Trong bã thải tinh bột sắn còn chứa nhiều nước nên vật chất khô chỉ chiếm 15,91%. Hàm lượng xơ và tinh bột còn lại tương đối cao, tương ứng 21,02% và 60,37% (tính theo VCK), kết quả này phụ thuộc vào loại sắn, cách chế biến, song phần lớn vì quá trình ép chưa kỹ nên hàm lượng tinh bột còn lại trong bã sắn là tương đối cao. Hàm lượng Protein thô và protein thực thấp, chỉ có 2,19% và 1,23% (theo VCK), KTS, lipit và axit hữu cơ tổng số thấp, tương ứng lần lượt là 2,01%, 0,52

% và 2,02 g/kg. HCN chiếm 9,4 mg/kg bã sắn tươi (Bảng 4.11). Kết quả phân tích này cho thấy, bã sắn tươi còn chứa khá nhiều nước (độ ẩm cao), hàm lượng protein thấp, hàm lượng xơ và tinh bột khá cao.

Bảng 4.11. Thành phần hóa học của bã sắn tươi

Thành phần (% VCK)

Mean (n=3)	SE
VCK	15,91	0,21
Protein thô	2,19	0,23
Protein thực	1,23	0,15
KTS	2,01	0,32
Lipit	0,52	0,24
Tinh bột	60,37	3,45
Xơ thô	21,01	1,23
Axit hữu cơ (g/kg tươi)	2,02	0,14
HCN (mg/kg tươi)	9,4	0,34

Các phân tích khác trên bã sắn cũng cho kết quả tương tự. Trong báo cáo của Nguyễn Hữu Văn & cs. (2008), bã sắn công nghiệp có VCK là 11,2%, protein thô 3,6%, xơ thô 31,2% và có 26,9 mg/kg tươi HCN. Le & cs. (2020) cho biết trong bã sắn có chứa 56% tinh bột và 35,9% xơ. Như vậy, có thể thấy rằng thành phần dinh dưỡng có trong bã sắn là rất thấp, trong khi đó hàm lượng tinh bột, xơ và các chất kháng dinh dưỡng như cyanua, tannin và phytate tương đối cao, do đó khi sử dụng làm thức ăn chăn nuôi khả năng tiêu hóa thấp, lượng thức ăn ăn vào ít và giảm khả năng sản suất của động vật.

Lên men đã được xác định là một trong số ít các phương pháp để có thể vừa khử được các chất kháng dinh dưỡng, vừa có khả năng cải thiện chất lượng protein nên đã được một số nước sử dụng để tăng cường giá trị sử dụng của sắn và phụ phẩm sắn cho cả con người và gia súc (Ubalua, 2007; Aro, 2008; Herago & Agonafir, 2017). Đối với bã sắn, hàm lượng xơ và tinh bột cao, các vi sinh vật không thể sử dụng trực tiếp để sinh trưởng và phát triển, chỉ một số ít vi sinh vật như nấm sợi (Aspergillus, Penicillium), nấm men Saccharomyces và vi khuẩn Baccilus có khả năng sinh ra một số enzyme ngoại bào như amylase, cellulase để thủy phân tinh bột và xơ thành đường đơn, song hoạt tính của chúng tương đối thấp (Pandey & cs., 2000; Cherry & Fidantsef, 2003; Singh R. & cs., 2011).

Đề tài tiến hành đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng việc bổ sung chế phẩm đa enzyme (α-amylase, gluco-amylase, cellulase), nấm men và vi khuẩn probiotic (Lactobacillus, Bacillus) để đường hóa tinh bột, xơ thành các đường đơn tạo cơ chất thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của các vi sinh vật nhằm tạo ra sản phẩm lên men giàu protein, nhiều vi khuẩn có lợi có thể sử dụng làm thức ăn chất lượng cao cho các động vật dạ dày đơn.

4.2.2. Đường hóa bã sắn

Bã thải tinh bột sắn là bã thải xơ để lại sau khi chiết xuất tinh bột từ củ sắn trong quá trình chế biến tinh bột sắn của các nhà máy. Trong bã sắn còn chứa hàm lượng cao của tinh bột và xơ. Nguồn tinh bột và xơ này không thể sử dụng trực tiếp cho quá trình lên men, cần phải qua giai đoạn đường hóa.

Quá trình đường hóa là quá trình chuyển hóa hoàn toàn dextrin thành đường khử. Trong cấu trúc của tinh bột, ngoài các liên kết α-1,4 glucoside để tạo nên cấu trúc của amylose, còn có các liên kết α-1,6 glucoside tạo nên phân nhánh amylopectin. Do đó, việc thủy phân hoàn toàn tinh bột cần có enzyme α-amylase và glucoamylase với những tác động đặc trưng riêng biệt. α-amylase được coi là