Tính Ổn Định Của Các Chủng Đột Biến Chọn Lọc

4.1.4. Tính ổn định của các chủng đột biến chọn lọc

Một trong những yêu cầu đối với các chủng vi sinh vật sử dụng trong công nghiệp là phải thuần khiết, ổn định về kiểu hình và kiểu gen, không bị hồi biến trong thời gian bảo quản và qua các thế hệ nuôi cấy. Tính ổn định về khả năng sản sinh enzyme của các chủng đột biến là thông số quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp đến tính kinh tế của việc sản xuất các enzyme công nghiệp. Tính ổn định về khả năng sinh enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 được xác định bằng việc cấy chuyển liên tiếp trên môi trường PDA trong 9 thế hệ. Sau mỗi lần nuôi cấy, tiến hành lên men xốp và tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme để xác định tính ổn định về khả năng sản sinh enzyme của chúng.

Kết quả cho thấy, sau 9 thế hệ nuôi cấy, khả năng sản sinh 3 loại enzyme glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 được duy trì tương đối ổn định (P > 0,05), hoạt tính trung bình của 3 loại enzyme glucoamylase, α-amylase và cellulase sau 9 thế hệ qua lên men xốp lần lượt là 28,28; 38,42 và 12,51 (U/g) (Bảng 4.2). Điều này chỉ ra rằng dòng đột biến Aspergillus niger GA15 này có đặc tính di truyền ổn định.

Bảng 4.2. Hoạt tính α-amylase, glucoamylase và cellulase của chủng đột biến

Aspergillus niger GA15 qua các thế hệ nuôi cấy

Hoạt tính enzyme (U/g), (Mean ± SE), n=3

Thế hệ	Glucoamylase (Mean ± SE)	α-amylase (Mean ± SE)	Cellulase (Mean ± SE)
1	27,15 ± 0,35	39,13 ± 0,5	12,81 ± 0,23
3	27,21 ± 0,85	38,62 ± 1,14	12,06 ± 0,85
5	29,67 ± 0,37	38,02 ± 0,75	12,36 ± 0,69
7	28,82 ± 1,09	38,21 ± 0,82	12,43 ± 0,55
9	28,54 ± 0,56	38,09 ± 0,52	12,87 ± 1,05
Trung bình	28,28	38,41	12,51

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 197 trang tài liệu này.

Li & cs. (2010) cũng cho biết các chủng đột biến thu được bằng gây đột biến bởi tia UV có khả năng sản sinh cellulase ổn định qua 9 thế hệ. Theo nghiên cứu của Vu & cs. (2009) cho biết, chủng Aspergillus niger XTG-4 bị gây đột biến bởi tia X và hóa chất NTG, hoạt tính của các enzyme đều ở mức cao (hoạt tính của CMCase, FPase và β-glucosidase tương ứng ổn định ở mức 37,84 U/ml, 35,18 U/ml và 27,12 U/ml) trên cám lúa mì trong suốt 19 thế hệ theo dõi.

Như vậy, sau khi gây đột biến chủng nấm sợiAspergillus niger A45.1 bằng tia UV và hóa chất NTG, lựa chọn được dòng đột biến Aspergillus niger

GA15 là dòng có hoạt tính đa enzyme glucoamylase, α-amylase, cellulase cao nhất và ổn định sau 9 thế hệ nuôi cấy với hoạt độ tương ứng lần lượt là 28,28; 38,41 và 12,51 (U/g).

4.1.5. Tối ưu điều kiện lên men xốp chủng nấm đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme (glucoamylase, α-amylase, cellulase)

Trong quá trình sản xuất enzyme, bên cạnh cải tiến chủng thì việc tối ưu môi trường lên men luôn được tiến hành để tăng sản lượng của sản phẩm mong muốn. Vi sinh vật cần được cung cấp đầy đủ các dưỡng chất cho sự sinh sản, phát triển và hoạt động. Các dưỡng chất này gồm các nguồn cung cấp carbon, nitơ, vitamin, khoáng cũng như các nguyên tố vi lượng khác và môi trường lên men cần được duy trì thường xuyên ở điều kiện tối ưu. Các thông số như nhiệt độ, áp suất, pH, lượng oxy phải được thường xuyên theo dõi và khống chế ở giá trị tối ưu.

4.1.5.1. Cơ chất

Cơ chất sử dụng trong lên men xốp thường không hòa tan trong nước. Thực tế, nước sẽ được hấp thụ vào các hạt cơ chất, sau đó vi sinh vật có thể sử dụng cho các hoạt động phát triển và trao đổi chất. Cơ chất sử dụng trong lên men xốp có thể được chia thành 3 nhóm, cơ chất giàu tinh bột (gạo, sắn, cám mì, cám gạo, bột ngô, bã khoai lang, bột chuối…); cơ chất giàu xơ (rơm lúa mì, rơm rạ, cám lúa mì, gỗ…) và nhóm cơ chất có đường hòa tan (bã nho, bã đậu, củ cải đường, chất thải dứa, bã cà phê…) (Manpreet & cs., 2005).

Trong nghiên cứu của đề tài, lựa chọn các loại cơ chất khác nhau là cám mì, cám gạo, vỏ trấu và mùn cưa để tiến hành lên men xốp chủng Aspergillus niger GA15 để lựa chọn cơ chất thích hợp nhất cho sản sinh đa enzyme) được sử dụng trong lên men để xác định ảnh hưởng của nó trong việc sản xuất đa enzyme α- glucoamylase, α-amylase và cellulase.

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của loại cơ chất đến khả năng sản xuất enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

Hoạt tính enzyme (U/g), n=3

Cơ chất	Glucoamylase (Mean ± SE)	α-amylase (Mean ± SE)	Celullase (Mean ± SE)
Cám gạo	27,01b ± 1,10	38,77b ± 1,58	12,20b ± 0,88
Cám mì	34,78a ± 1,54	49,88a ± 2,19	16,74a ± 0,26
Mùn cưa	17,47c ± 0,83	25,15c ± 1,19	9,81b ± 0,79
Trấu	13,34c ± 0,60	19,25c ± 0,86	6,34c ± 0,15

Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05)

Kết quả cho thấy, ở các môi trường cơ chất khác nhau, sự sản sinh glucoamylase, amylase và cellulase của chủng Aspergillus niger GA15 là khác nhau rõ rệt (P<0,05) (Bảng 4.3, Hình 4.4).

Sự sản sinh enzyme cao nhất được quan sát trên môi trường có cơ chất là cám mì, với hoạt tính của glucoamylase, α-amylase và cellulase lần lượt là 34,78; 49,88 và 16,74 (U/g), hoạt tính thấp với cơ chất là trấu và mùn cưa. So với môi trường có cơ chất cám gạo (đối chứng) thì hoạt tính của các enzyme này cũng cao hơn hẳn. Do đó, cám mì được lựa chọn sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 4.4. Ảnh hưởng của loại cơ chất đến sinh tổng hợp enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

Sự khác nhau trong sản xuất enzyme khi sử dụng các cơ chất khác nhau trong lên men xốp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm bản chất cấu trúc của cơ chất, độ xốp, và ảnh hưởng của nó đến sự xâm nhập của vi sinh vật. Vi sinh vật thường có xu hướng lựa chọn những cơ chất có độ xốp cao hoặc vật liệu giòn (dễ phân hủy) để làm môi trường dinh dưỡng vì nó dễ dàng sinh trưởng vào bên trong các hạt cơ chất, từ đó ảnh hưởng đến hiệu suất sản sinh enzyme của vi sinh vật. Chính vì vậy năng suất enzyme bị ảnh hưởng nhiều bởi kích thước của các hạt cơ chất, những cơ chất mà có kích thước hạt nhỏ vừa phải, hợp lý, sẽ làm tăng hiệu suất sản sinh enzyme bằng cách tăng diện tích tiếp xúc bề mặt cho vi sinh vật, việc vận chuyển oxi và nhiệt được thuân lợi (Bedan & cs., 2014; Kumari & cs., 2012). Theo Vu & cs. (2011) và Vu & cs. (2010) cũng đã chỉ ra rằng, cám mì là nguồn cơ chất thích hợp nhất trong lên men xốp để sản xuất cellulase và enzyme thủy phân tinh bột sống bởi các chủng đột biến chọn lọc.

4.1.5.2. Độ ẩm

Trong quá trình lên men, điều quan trọng là phải cung cấp một hàm lượng nước tối ưu và kiểm soát hoạt độ nước của cơ chất, vì sự có mặt của nước ở nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn sẽ ảnh hưởng xấu đến hoạt động của vi sinh vật. Hơn nữa, nước có tác động lớn đến các tính chất lý hoá của chất rắn và điều này ảnh hưởng đến tổng sản lượng (năng suất) của quá trình lên men (Pandey & cs., 1999).

Cám mì được bổ sung nước để có độ ẩm khác nhau. Nghiên cứu nhằm chọn độ ẩm tối ưu cho sản xuất đa enzyme.

Bảng 4.4. Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 ở các độ ẩm cơ chất khác nhau

Độ ẩm (%, w/v)

Hoạt tính enzyme (U/g), n=3
Glucoamylase (Mean ± SE)	α-amylase (Mean ± SE)	Celullase (Mean ± SE)
20	16,84c ± 0,86	21,82c ± 1,11	10,66c ± 1,30
30	33,99a ± 0,61	45,53a ± 0,53	16,59b ± 1,99
40	34,71a ± 1,56	46,42a ± 1,20	17,73b ± 0,37
50	39,16a ± 0,79	52,64a ± 0,26	22,75a ± 0,69
60	22,86b ± 1,88	30,04b ± 2,22	10,16c ± 0,94
70	15,51c ± 1,17	19,95c ± 1,61	7,02c ± 0,87

Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05)

Kết quả cho thấy, hoạt tính của enzyme glucoamylase và α-amylase của chủng Aspergillus niger GA15 đạt cao ở độ ẩm 30, 40 và 50%, thấp ở độ ẩm 20 và 70%. Hoạt tính của cellulase đạt cao nhất ở 50% với 22,75 U/g, thấp ở cơ chất có độ ẩm 20, 60 và 70%. Vì vậy, lựa chọn 50% là độ ẩm thích hợp cho sự sản xuất của cả 3 loại glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng nấm sợi Aspergillus niger GA15 với hoạt tính lần lượt là 39,16; 52,64 và 22,74 (U/g) (Bảng 4.4, Hình 4.5). Tỷ lệ độ ẩm 50% này được sử dụng tiếp cho các thí nghiệm tiếp theo.

Trong lên men rắn, độ ẩm có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp và tiết enzyme. Mức độ thủy phân cơ chất có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng của nấm sợi và sau đó là sự sản sinh enzyme. Nước làm cho cơ chất trương lên và tăng khả năng sử dụng cơ chất của vi sinh vật. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm giảm độ rỗng bề mặt của môi trường, giảm sự lưu thông oxy trong môi trường từ đó làm giảm khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Ngược lại, ở độ ẩm thấp sẽ làm giảm mức độ hòa tan các chất dinh dưỡng của cơ chất từ đó sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi (Bedan & cs., 2014)

Hình 4.5. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến sinh tổng hợp glucoamylase α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

Cơ chất sử dụng trong lên men xốp không tan trong nước, do đó nước được hấp thụ trên bề mặt của các hạt cơ chất cho sự sử dụng của các vi sinh vật để sinh trưởng và từ đó sản sinh ra enzyme. Theo Vu & cs. (2010) cũng cho biết tỷ lệ độ ẩm tối ưu cho việc sản sinh enzyme thủy phân tinh bột sống sử dụng chủng đột biến Aspergillus niger XN15 là 50% với hoạt tính là 62,52U/g.

4.1.5.3. Nhiệt độ

Nhiệt độ là thông số quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến việc sản sinh enzyme của chủng Aspergillus niger GA15, tiến hành lên men xốp với cơ chất cám mì, độ ẩm 50% ở các nhiệt độ lên men khác nhau là 20, 25, 30, 35, 40 và 45°C.

Kết quả (Bảng 4.5, Hình 4.6) cho thấy, ở dải nhiệt độ từ 20 - 45oC, hoạt tính của 3 loại enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 là khác nhau rõ rệt (p<0,05). Hoạt tính của glucoamylase đạt cao nhất ở 30oC với hoạt tính là 39,77 (U/g) và thấp nhất ở 45oC với hoạt tính 7,33 (U/g). Hoạt tính của enzyme α- amylase và celullase cũng có xu hướng tương tự, đạt cao nhất ở 30oC với hoạt tính của 2 enzyme tương ứng lần lượt là 52,24 và 22,77 (U/g), đạt thấp ở nhiệt độ 20, 40 và 45oC.

Bảng 4.5. Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 ở các nhiệt độ lên men khác nhau

Hoạt tính enzyme (U/g), n=3

Nhiệt độ (oC)	Glucoamylase (Mean ± SE)	α-amylase (Mean ± SE)	Celullase (Mean ± SE)
20	14.77c ± 0.97	20.53c ± 1.39	6.01c ± 0.60
25	27,66b ± 2,17	38,94b ± 3,1	13,06b ± 1,72
30	39,77a ± 1,1	52,24a ± 1,56	22,77a ± 0.21
35	24.24b ± 1.68	34.05b ± 2.40	10,53b ± 0,33
40	13,22cd ± 0,58	18,3cd ± 0,83	10,66b ± 0.94
45	7,33d ± 1,15	9,89d ± 1.64	4.55c ± 0.33

Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05)

Nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn nhiệt độ tối ưu đều làm giảm sự sản xuất enzyme. Ở nhiệt độ thấp không thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm mốc và kết quả là sự sản xuất enzyme giảm. Trong khi ở nhiệt độ cao sẽ làm giảm lượng nước của môi trường do bốc hơi dẫn tới ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của các tế bào, thêm vào đó nhiệt độ cao hơn sẽ làm giảm sự tập trung của oxy dẫn đến việc sản xuất enzyme giảm. Điều này cũng có thể được lý giải là do ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính và thay đổi cấu trúc (Bedan & cs., 2014).

Hình 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

Như vậy, nhiệt độ 30oC được tìm thấy là nhiệt độ tốt nhất cho sự sản sinh của glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 và được lựa chọn là nhiệt độ lên men thích hợp trong các nghiên cứu tiếp theo.

Nhiệt độ tối ưu cho sản sinh các enzyme khác nhau giữa các loài nấm là không giống nhau. Theo Vu & cs. (2010), lên men ở 30oC là điều kiện tối ưu cho sản xuất enzyme thủy phân tinh bột sống của chủng Aspergillus niger XN15. Ở nhiệt độ 35oC là thích hợp cho chủng Aspergillus NRRL 3112 và Aspergillus NRRL 337 để sản sinh glucoamylase (Ellaiah & cs., 2002). Kavya & Padmavathi (2009) cho biết chủng nấm sợi A.niger cho hoạt tính của xylanase cao nhất là 16 U/ml khi lên men xốp ở 45oC, thấp nhất ở 25oC. Varalakshmi & cs. (2009) báo cáo rằng sản xuất enzyme của chủng A. niger tốt nhất ở nhiệt độ phòng cả trong lên men chìm và lên men lỏng, Kathiresan & Manivannan (2006) lại cho rằng ở 30oC là nhiệt độ tốt nhất để sản xuất enzyme bởi chủng Penicillium fallutanum. Điều này cho thấy rõ ràng rằng quá trình sản xuất enzyme trong lên men xốp bị ảnh hưởng nhiều bởi nhiệt độ. Đa số, nấm sợi cho sản sinh enzyme cao ở nhiệt độ 30oC - 37oC, tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sản xuất enzyme được báo cáo là ở 30°C (Gupta & cs., 2008; Alva & cs., 2007).

4.1.5.4. pH môi trường

pH của môi trường lên men cũng đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật cũng như hoạt động của enzyme. Tiến hành nuôi cấy chủng Aspergillus niger GA15 trên môi trường có cơ chất cám mì, độ ẩm 50%, nhiệt độ 30oC, pH môi trường nuôi cấy được điều chỉnh từ 3 đến 7.

Kết quả cho thấy, khả năng sản xuất enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 trên môi trường có pH khác nhau là khác nhau (Bảng 4.6). Hoạt tính của cả 3 enzyme thấp khi lên men xốp ở môi trường có pH 3, sau đó tăng dần và đạt tối đa ở pH5,5 với hoạt tính enzyme lần lượt là 42,46, 55,32 và 22,96 (U/g), sau đó giảm dần và đạt thấp nhất ở pH7. Như vậy, pH5,5 được quan sát là tối ưu cho sản xuất glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng Aspergillus niger GA15. Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH, ngoài giá trị pH tối ưu, sự sinh trưởng và sản xuất enzyme của vi sinh vật giảm do thay đổi cấu trúc bậc 3 của protein và ảnh hưởng đến độ hòa tan và sự ion hóa của cơ chất (Bedan & cs., 2014).

Bảng 4.6. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 trên môi trường có pH khác nhau

Hoạt tính enzyme (U/g), n=3

pH	Glucoamylase (Mean ± SE)	α-amylase (Mean ± SE)	Celullase (Mean ± SE)
3	15,76e ± 0,85	20,38d ± 1,22	11,76bcd ± 0,90
3,5	18,87cd ± 1,07	24,82cd ± 1,53	12,52bcd ± 1,15
4	21,45d ± 1,00	28,51c ± 1,43	12,85bc ± 0,59
4,5	27,85c ± 0,96	37,65b ± 1,37	14,78bc ± 0,77
5	37,23b ± 0,33	51,05a ± 0,47	21,62a ± 0,92
5,5	42,46a ± 1,41	55,32a ± 2,01	22,96a ± 0,76
6	30,54c ± 0,95	41,49b ± 1,35	16,20b ± 1,5
6,5	21,07d ± 0,96	27,97c ± 1,37	9,94cd ± 0,08
7	14,78e ± 0,33	18,98d ± 0,47	5,87d ± 0,44

Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05)

)

Hình 4.7. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

pH môi trường tối ưu khác nhau phụ thuộc chủng loại vi sinh vật và loại enzyme được sản xuất. Theo Vardhini & cs. (2013), độ pH tối ưu cho sản xuất α- amylase bởi A. niger là 6,5 với hoạt tính là 40 U/g. Vu & cs. (2010) cho biết pH tối ưu cho sản xuất enzyme thủy phân tinh bột sống bởi chủng Aspergillus niger XN 15 là 4,5. Theo Suganthi & cs., (2011), chủng Aspergillus niger BAN 3E khi