Tình Hình Thiết Lập Chất Chuẩn Monotropein Và Nystose

- Nhiệt độ nóng chảy: 134 oC -135 oC.

- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị ngọt, dễ tan trong nước (745 g/l) [63].

Do thành phần oligosaccharid không hấp thụ tia UV, nên detector UV không phù hợp để phân tích. Để phân tích oligosaccharid một số detector như khúc xạ kế vi sai, tán xạ bay hơi... [37], [47].

1.2.2.2. Tác dụng dược lý

- Từ các nghiên cứu, thử nghiệm trên người và chuột cho thấy nhóm FOS (bao gồm chủ yếu là 1-kestose, nystose và fructofuranosyl nystose) có tác dụng kích thích sự phát triển của các vi sinh vật có lợi như bifidobacteria và giảm số lượng vi khuẩn gây hại, đặc biệt là Clostridia perfringens. FOS còn có thể cải thiện sự hấp thu và lưu giữ khoáng chất, chủ yếu là calci, magnesi ở ruột. FOS giúp tăng cường miễn dịch hệ tiêu hóa, giảm khả năng viêm ruột và ung thư ruột kết nhờ cải thiện cấu trúc niêm mạc, làm dày lớp chất nhầy bảo vệ, phát triển hệ bạch huyết và các nang Peyer. FOS không được cơ thể hấp thu vì không hoặc ít bị thủy phân bởi hệ men đường ruột nên lượng đường trong máu không bị biến động sau khi uống, phù hợp cho bệnh nhân tiểu đường và người bị bệnh béo phì. Hơn nữa, các nghiên cứu đã chứng minh rằng FOS làm giảm tổng hợp cholesterol, triglycerid máu, cholesterol toàn phần và LDL cholesterol nhờ cơ chế giảm tổng hợp chất béo ở gan bằng cách giảm sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các enzym lipogen. Điều này rất có lợi cho bệnh nhân mắc bệnh tim mạch [72].

- Theo các nghiên cứu, oligosaccharid trong rễ M. officinalis How cho thấy có tác dụng bảo vệ ADN của tinh trùng người khỏi bị phá hủy bởi H2O2, góp phần trong điều trị vô sinh [45]. Oligosaccharid còn được chứng minh có thể cải thiện khả năng ghi nhớ trên chuột - được gây mất trí nhớ bằng beta-amyloid, chống trầm cảm, bảo vệ xương, chống mất xương [92], [97], [98].

- Thành phần oligosaccharid từ Ba kích có tác dụng chống trầm cảm [34], làm giảm đáng kể các biểu hiện của hành vi trầm cảm gây ra bởi mô hình stress trường diễn không thể dự đoán (chronic unpredictable stress) trên thử nghiệm lựa chọn sucrose và thử nghiệm bơi cưỡng bức [95].

Nystose là hoạt chất có tác dụng dược lý của dược liệu rễ Ba kích. Do đó,

nystose là “marker” của dược liệu rễ Ba kích.

1.2.2.3. Phương pháp phân tích nystose

a. Phương pháp TLC

Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông [47] tiến hành định tính nystose trong dược liệu bằng phương pháp TLC với các điều kiện như sau:

Bản mỏng HPTLC silica gel F254. Bình triển khai sắc ký loại 2 ngăn.

Pha động: Hỗn hợp dung môi acetat – nước – acid formic – acid acetic băng

theo tỷ lệ thể tích (6:3:2:2).

Thuốc thử hiện màu: Cho từ từ 11 ml acid sulfuric đặc vào 89 ml EtOH. Thêm 2,75 g -naphthol và 7 ml nước.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,5 mg chất chuẩn nystose, hoà tan trong 50 ml MeOH.

Dung dịch thử: Cân khoảng 0,5 g bột dược liệu rễ Ba kích vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml MeOH. Lắc siêu âm trong 15 phút. Lọc lấy dịch lọc.

Tiến hành: Chấm lần lượt 15 µl dung dịch chuẩn và 1,5 µl dung dịch thử lên bản mỏng. Trước khi triển khai sắc ký, thêm pha động vào 1 ngăn, bản mỏng để vào ngăn còn lại, đậy nắp bình và để yên 15 phút. Nghiêng bình sắc ký để pha động tràn sang ngăn chứa bản mỏng. Triển khai sắc ký đến khi pha động đi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, đánh dấu mức di chuyển của pha động trước, sấy khô bản mỏng. Phun thuốc thử hiện màu lên bản mỏng, sấy ở nhiệt độ khoảng 100 oC đến khi xuất hiện vết. So sánh giá trị Rf của vết chính cho bởi dung dịch thử với vết của nystose của dung dịch chuẩn.

b. Phương pháp HPLC

Hiện nay Dược điển Trung Quốc năm 2015 và Bộ tiêu chuẩn dược liệu chuẩn Hồng Kông đã tiến hành định lượng nystose trong Morinda officinalis với phương pháp tiến hành như sau:

* Dược điển Trung Quốc năm 2015

- Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký RP18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm). Pha động: MeOH

- Nước (3 : 97). Detector ELSD: Nhiệt độ ống bay hơi: 90 ºC. Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

- Dung dịch chuẩn: Tiến hành pha dung dịch chuẩn nystose trong pha động để

có nồng độ khoảng 200 µg/ml.

- Dung dịch thử: Nghiền dược liệu rễ Ba kích thành bột mịn và cho rây qua rây 250 µm. Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu rễ Ba kích vào bình nón nút mài 100 ml, thêm chính xác 50 ml pha động, đậy nắp, cân xác định khối lượng. Đun sôi hồi lưu trong cách thủy 30 phút, để nguội, cân lại, bổ sung pha động nếu thiếu so với khối lượng ban đầu.

- Tiến hành tiêm 10 µl và 30 µl dung dịch chuẩn và 10 µl dung dịch thử, ghi lại sắc ký đồ. Yêu cầu số đĩa lý thuyết tính theo pic nystose không thấp hơn 2.000. Tính hàm lượng nystose (tính theo dược liệu khô kiệt) dựa vào phương pháp đường chuẩn 2 điểm giữa mối tương quan giữa Ln(nồng độ) và Ln(diện tích pic) của nystose.

* Bộ tiêu chuẩn dược liệu chuẩn Hồng Kông

- Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký HILIC (250 mm x 4,6 mm, 5 µm). Detector ELSD: Nhiệt độ ống bay hơi: 92 ºC; tốc độ dòng khí mang nitơ: 1,2 ml/phút. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Pha động: Chương trình gradient dung môi trình bày tại bảng 1.3.

Bảng 1.3. Chương trình gradient dung môi định lượng nystose

Thời gian (phút)

Nước

(% thể tích/thể tích)

Acetonitril

(% thể tích/thể tích)

0 – 18

15  28

85  72

18 - 40

28  40

72  60

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 4 mg chất chuẩn nystose, hoà tan và định mức thành 2 ml bằng EtOH 60 %. Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn này trong EtOH 60 % để thu được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ nystose khoảng: 160, 200, 320, 600, 720 µg/ml.

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,25 g bột dược liệu rễ Ba kích vào bình nón nút mài 50 ml, thêm 10 ml EtOH 60 %. Lắc siêu âm khoảng 15 phút. Lấy dịch chiết và lọc vào bình định mức 25 ml. Lặp lại quá trình chiết, sau đó rửa bã dược liệu bằng EtOH 60 %. Gộp các dịch chiết vào bình định mức trên, thêm EtOH 60 % đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

- Tiêm lặp lại 10 µl dung dịch chuẩn nystose có nồng độ 320 µg/ml, ghi lại sắc ký đồ. Yêu cầu của độ thích hợp của hệ thống sắc ký: RSD của diện tích pic nystose trong 5 lần tiêm lặp lại không quá 5,0 %; RSD của thời gian lưu pic nystose không quá 2,0 %; số đĩa lý thuyết của cột tính trên pic nystose không dưới 10.000. Độ phân giải giữa pic nystose và pic gần nhất không dưới 1,5.

- Tiến hành tiêm lần lượt 10 µl các dung dịch chuẩn và 10 µl dung dịch thử, ghi lại sắc ký đồ. Tính hàm lượng nystose (tính theo dược liệu khô kiệt) dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính giữa mối tương quan giữa Ln(nồng độ) và Ln(diện tích pic) của nystose.

Như vậy, cả 2 phương pháp định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích đều sử dụng phương pháp HPLC detetector ELSD. Tuy nhiên, phương pháp trong Dược điển Trung Quốc sử dụng cột RP18 – đây là cột sắc ký thông dụng trong các phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Phương pháp định lượng nystose trong Bộ tiêu chuẩn dược liệu chuẩn Hồng Kông sử dụng cột HILIC – cột này ít thông dụng trong các phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

1.3. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose

1.3.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose trên thế giới và tại Việt Nam

Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh là 2 đơn vị được Bộ Y tế giao nhiệm vụ thiết lập chất chuẩn Dược điển Việt Nam và chuẩn phòng thí nghiệm cung cấp cho hệ thống kiểm nghiệm trên toàn quốc. Tính đến thời điểm tháng 03/2020, quỹ chất chuẩn của 2 Viện có khoảng hơn 600 chất chuẩn hóa dược và khoảng 40 chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu [20], [21], [22]. Trong danh mục các chất chuẩn chiết từ dược liệu của 2 Viện, không có chất chuẩn monotropein và nystose.

Trên thế giới việc nghiên cứu và phân phối chất chuẩn chủ yếu bởi các tổ chức như Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ (cung cấp USPRS), Ban thư ký kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (cung cấp EPRS), Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn hoá học của Tổ chức Y tế Thế giới (cung cấp ICRS) và Hội đồng chất chuẩn khu vực ASEAN (cung cấp ARS). Hiện nay, tất cả các tổ chức này đều chưa thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose.

Bên cạnh đó đã có một số đơn vị đã thiết lập được chất chuẩn monotropein và nystose chiết được từ dược liệu rễ Ba kích, cụ thể được trình bày tại Bảng 1.4.

Bảng 1.4. Một số đơn vị cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose

Stt

Tên chất chuẩn	Nhà cung cấp	Hàm lượng	Quy cách đóng gói	Giá thành
1	Monotropein	Sigma – Aldrich [65]	≥ 98,0 % (HPLC)	Lọ 5 mg	290 USD
2	Monotropein	Chemfaces [33]	≥ 98,0 % (HPLC)	Lọ 20 mg	90 USD
3	Monotropein	Biopurify Phytochemicals [29]	98,0 % (HPLC)	Lọ 20 mg	65 USD
4	Nystose	Sigma – Aldrich [66]	≥ 98,0 % (HPLC)	Lọ 25mg	82 USD
5	Nystose	Chemfaces [34]	≥ 98,0 % (HPLC)	Lọ 20 mg	138 USD
6	Nystose	TRC-Canada [82]	-	Lọ 10 mg	45 USD
7	Nystose	Medchem Express [64]	≥ 98,0 % (HPLC)	Lọ 10 mg	50 USD
8	Nystose	Viện Kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm Trung ương Trung Quốc	92,4 % (HPLC)	Lọ 20 mg	142 USD

Từ Bảng 1.4 có thể thấy, một số công ty trên thế giới có cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose trên thế giới có giá thành tương đối cao (từ 45 – 290 USD cho 1 lọ chất chuẩn có quy cách đóng gói từ 5 mg – 25 mg, hàm lượng chất chuẩn từ 92 % - 98 %) và thời gian cung cấp mất nhiều thời gian (tối thiểu từ 6 – 8 tuần). Trong khi đó, tại Việt Nam chưa có đơn vị nào thiết lập cũng như cung cấp những chất chuẩn này. Do đó, cần phải phân lập và thiết lập chuẩn monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích để phục vụ cho hệ thống kiểm nghiệm dùng cho kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích tại Việt Nam.

1.3.2. Phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ Ba kích

1.3.2.1. Nghiên cứu chiết xuất phân lập monotropein từ Ba kích

Monotropein và hỗn hợp các iridoid tan trong nước, ethanol loãng và methanol. Nước hoặc EtOH 50 % thường được dùng làm dung môi chiết xuất, sử dụng kết hợp các phương pháp: cô đặc, lọc, kết tinh, sắc ký, chiết dung môi... Bên cạnh đó, MeOH thường được dùng để chiết xuất monotropein với mục đích loại các thành phần khác.

Liu Dongfeng và cộng sự [61] đã xây dựng qui trình chiết xuất monotropein từ

Morinda offcinalis gồm các bước sau:

- Chiết xuất: Nghiền rễ Ba kích thành bột, rây qua lưới cỡ 40, thêm lượng ethanol 30% sao cho tỷ lệ so với dược liệu là 8 – 10 lần so với lượng dược liệu (thể tích/khối lượng), lắc siêu âm, lọc lấy dịch chiết, đem cô bay hơi dung môi thu được cao chiết EtOH.

- Phân lập: Hoà tan cao chiết khô thu được vào nước, lần lượt chiết với dung môi ethyl acetat, n – butanol, lấy lớp propyl carbinol rồi tiến hành cô bay hơi dưới áp suất giảm thu được cao chiết. Hoà tan cao chiết trong nước, nạp lên cột resin HPD600, rửa giải bằng dung dịch NaOH có pH = 10, thu dịch rửa giải. Điều chỉnh pH của dịch rửa giải về pH trung tính. Nạp dịch này lên cột resin HPD600, tiến hành rửa giải bằng EtOH 30 %, thu lấy dịch EtOH 30 %.

- Tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại: Cô bay hơi dịch EtOH 30 % thu được cao EtOH. Hoà tan cao EtOH trong ethyl acetat, cô bay hơi thu được chất kết tinh. Lặp lại quy trình 2 lần thu được monotropein có độ tinh khiết là 92,54 % (phương pháp HPLC) [61].

Phương pháp này có ưu điểm là giá thành thấp nhưng độ tinh khiết của nguyên liệu không cao. Việc sử dụng dung môi EtOH 30 % và cột resin có nhược điểm là không loại bỏ hoàn toàn được lượng các thành phần khác có tính đồng tan hoặc độ phân cực tương tự với monotropein.

1.3.2.2. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế nystose từ Ba kích.

Liu Dongfeng và cộng sự [60] đã xây dựng phương pháp chiết xuất nystose từ

Morinda offcinalis gồm các bước sau:

- Nghiền dược liệu Morinda officinalis, tiến hành chiết siêu âm 2-3 lần (20-40 phút một lần) với lượng nước khoảng 5-10 lần lượng nguyên liệu, lọc qua màng lọc celulose, gộp dịch chiết và cô dịch chiết thu được cao. Hoà tan cao trong EtOH 95 %, để kết tủa qua đêm và thu chất kết tủa.

- Hòa tan chất kết tủa thu được trong một lượng vừa phải nước khử ion, trộn đều với silica gel, sấy khô, nhồi cột sắc ký, lần lượt rửa giải với methanol và nước, thu lấy dung dịch rửa, cô đặc và tiến hành kết tủa bằng ethanol và làm đông khô để thu được nystose có độ tinh khiết 95,2 % [60].

Khi được sử dụng để sản xuất nystose, phương pháp này có lợi thế về hoạt động công nghệ đơn giản và năng suất cao, và có thể dễ dàng thực hiện công nghiệp hóa. Tuy nhiên, việc chỉ sử dụng sắc ký cột silica gel và màng lọc cellulose chưa thể loại bỏ triệt để các thành phần khác, độ tinh khiết của sản phẩm không cao.

1.4. Phương pháp phân tích trình tự ADN trong định danh loài Morinda officinalis How

Ba kích (Morinda officinalis How) hay bị nhầm lẫn do hình dáng gần giống với Ba kích lông (Morinda cochinchinensis Lour), cây Mặt quỷ (Morinda villosa Hook), cây giang mủ (Zygostelma benthami Baillon var. lineare Cost). Việc định danh dược liệu bằng hình thái học là một công tác khó khăn vì sau khi thu hái và xử lý thì không thể thu thập đầy đủ thông tin về đặc điểm thực vật của mẫu dược liệu. Do đó, cần có một phương pháp bổ trợ cho những phương pháp có sẵn để giúp cho vấn đề định danh Ba kích được chính xác. Và phương pháp định danh bằng phân tích trình tự ADN là một trong những phương pháp chính xác đáp ứng yêu cầu đó.

Phân tích trình tự các nucleotid của gen theo nguyên lý mã vạch (DNA barcoding) là việc phân tích một hoặc nhiều đoạn ngắn chuỗi trình tự gen được chuẩn hóa trích xuất từ bộ gen để định danh loài cần nghiên cứu [54].

1.4.1. Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật

Mã vạch ADN (DNA barcoding, chỉ thị ADN) là một hoặc nhiều đoạn gen ngắn, chuẩn của các loài sinh vật đã được xác định nằm trong ngân hàng gen, được sử dụng để định danh các loài sinh vật chưa biết bằng phương pháp so sánh với trình tự ADN của ngân hàng gen.

Qui trình ứng dụng mã vạch ADN để phân loại và theo dõi cây phân loài cho thực vật được thiết kế và chuẩn hóa để các nhà khoa học trên toàn thế giới có thể tra cứu cũng như cập nhật thông tin vào ngân hàng dữ liệu của trình tự các đoạn gen quy ước. Vì vậy, cần phải tuân thủ quy trình được chuẩn hóa hoặc sử dụng các bộ kit thiết kế sẵn cho việc phân tích các hệ gen cần nghiên cứu như ADN nhiễm sắc thể, ADN ty thể hoặc ADN lạp thể, và đều theo qui trình chung như sau:

- Chọn bộ gen cần phân tích là bộ gen ty thể, lạp thể hay nhân. Chiết tách và tinh chế DNA gen đích theo quy trình tương ứng.

- Khuếch đại đoạn gen cần phân tích bằng mồi chung hoặc mồi đặc hiệu.

- Giải trình tự đoạn gen khuếch đại thu được.

- So sánh với ngân hàng dữ liệu gen (GeneBank).

Tính đến hết tháng 4/2018, đã có tổng cộng 208.452.303 trình tự gen quy ước được lưu trữ trên GeneBank của NCBI và hiện nay cơ sở dữ liệu này đang tăng từng ngày [68].

1.4.2. Phương pháp khuếch đại gen (PCR)

1.4.2.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR

Phương pháp PCR là một phương pháp tổng hợp ADN dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích ADN ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn ADN này [15].

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau:

- Bước 1 (Biến tính tách đôi sợi ADN, denaturation): Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95 oC) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử ADN mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.

- Bước 2 (bắt cặp, annealing): Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 oC. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.

- Bước 3 (kéo dài, elongation – extension): Nhiệt độ được tăng lên 72 oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotid lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự ADN khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng ADN khuếch đại = m x 2n trong đó: m: là số bản sao của chuỗi mã hóa; n: là số chu kỳ.

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một ADN đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một ADN đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.

Nguyên tắc của phương pháp PCR được trình bày trong Hình 1.3.