Hoạt Tính Chống Oxi Hóa: Thực Hiện Theo Phương Pháp Dpph [80], [81]

COSY, NOESY …).

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis [76], [77]

 Chủng vi sinh vật kiểm định: Chủng vi sinh vật gây bệnh ở người là vi khuẩn

Bacillus subtilis (Bs) (ATCC 6633)

 Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar).

 Phương pháp: Phương pháp pha loãng nồng độ

- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.

- Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 10 nồng

độ).

- Mẫu ban đầu có nồng độ 40mg/ml được pha loãng thành các nồng độ khác

nhau (256μg/ml; 64μg/ml; 16μg/ml; 4μg/ml; 1μg/ml) để thử hoạt tính với các chủng vi sinh vật.

- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến hành thử.

- Lấy 10 μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200μl dung dịch vi sinh vật, ủ ở 370C. Sau 24 giờ, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data.

 Chất đối chứng: Kháng sinh Ampicilin với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 - 2μg/ml.

(Thực hiện ở Viện Sinh hóa thực vật Halle - CHLB Đức).

2.2.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào [78], [79]

 Các dòng tế bào: Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC

gồm:

- KB (Human epidermic carcinoma) - ung thư biểu mô.

- HepG2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan.

- LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi.

- MCF - 7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.

 Phương pháp: Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau.

 Thử độc tế bào:

- Cho 200μl dung dịch tế bào ở nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào HepG2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1.

- Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128μg/ml; 32μg/ml; 8μg/ml; 2μg/ml; 0,5μg/ml. Ủ trong điều kiện 370C, 5% CO2 trong 3 ngày.

- Giếng điều khiển gồm 200μl dung dịch tế bào nồng độ 3.104 tế bào/ml, ủ ở 370C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50μl MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 370C 4 giờ.

- Loại bỏ môi trường, thêm 100μl DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

 Tính kết quả:

GI%: Phần trăm kìm hãm sự phát triển (Growth Inhibition).

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả GI% của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.

(Thực hiện ở Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam).

2.2.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa: Thực hiện theo phương pháp DPPH [80], [81]

 Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng = 517nm.

 Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1mM trong methanol (MeOH). Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 256; 64; 16; 4; 1g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bước sóng 517nm.

 Tính toán: % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:

EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.

 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học:

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH

1.8000

1.6000

1.4000

1.2000

1.0000

0.8000

0.6000

0.4000

0.2000

0.0000

y = 0.3225x + 0.0241

R2 = 0.9938

0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000

Nồng độ DPPH mM

Mật độ quang học (OD)

(Thực hiện ở Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam).

CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM

3.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)

Khi nghiên cứu loài Thông lá dẹt, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sơ bộ các cặn chiết từ mẫu lá và mẫu rễ của loài này trên sắc ký lớp mỏng. Kết quả cho thấy, sắc ký đồ của các cặn chiết của mẫu rễ cho nhiều vết rõ ràng hơn so với các cặn chiết của mẫu lá. Ngoài ra, khi tiến hành phân lập chất từ cặn chiết n-hexane của lá thì thu được β-sitosterol glucoside và β-sitosterol, hai chất thường gặp trong nhiều loài thực vật. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn mẫu rễ loài này để nghiên cứu kỹ hơn.

Rễ loài Thông lá dẹt

(1,1kg)

Chiết với MeOH:Nước (80:20) (4 lần)

Dịch MeOH

Chiết với n-hexane (3 lần)

Dịch nước còn lại

Cất loại dung môi

Dịch n-hexane

Cặn n-hexane

(3g)

Chiết với n- BuOH (3 lần)

Dịch nước còn lại

Chiết với EtOAc (3 lần)

Dịch nước còn lại

Cất loại dung môi

Cặn EtOAc

(75g)

Dịch EtOAc

Cặn n-BuOH

(20g)

Dịch n-BuOH

Cất loại dung môi

Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết rễ Thông lá dẹt

Mẫu rễ Thông lá dẹt đã sấy khô (1,1kg), nghiền nhỏ được ngâm chiết bốn lần trong hỗn hợp MeOH/nước (80:20), ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi MeOH dưới áp suất giảm, dịch nước còn lại được chiết phân lớp lần lượt với n- hexane, EtOAc và n-BuOH (mỗi loại chiết 1,5l x 3lần). Cất loại dung môi của các dịch chiết thu được dưới áp suất giảm thu được 3; 75 và 20g cặn các chiết tương ứng (Sơ đồ 3.1).

3.1.1. Cặn chiết n-hexane

Hoà tan 1,5mg cặn chiết n-hexane đã được làm khô bằng Na2SO4 khan trong 1ml n-hexane tinh khiết loại dùng cho sắc ký và phân tích phổ. Việc phân tích được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC/MS với cột mao quản chuyên dụng. Chương trình nhiệt độ với điều kiện 60oC/2 phút; tăng nhiệt độ 4oC/1 phút cho đến 220oC, sau đó lại tăng nhiệt độ 20o/phút cho đến 260oC; với He làm khí mang. Việc xác nhận các cấu tử được thực hiện bằng cách so sánh các dữ kiện phổ MS của chúng với phổ chuẩn đã được công bố có trong thư viện Willey/Chemstation HP. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.1.

3.1.2. Cặn chiết ethyl acetate (EtOAc)

3.1.2.1. Phân lập chất

Cặn chiết EtOAc (60g) được tiến hành trên sắc ký cột silica gel với các hệ dung môi giải hấp là n-hexane-CH2Cl2 gradient (80:20 → 10:90) và sau đó là hệ dung môi CH2Cl2-MeOH gradient (98:2 →90:10) thu được 12 phân đoạn, ký hiệu PKE1→PKE12.

Phân đoạn 2 (PKE2) xuất hiện kết tinh màu vàng trong hỗn hợp dung môi CH2Cl2-MeOH. Lọc kết tinh và rửa với n-hexane thu được hợp chất PK2 (45mg). Dung dịch còn lại của phân đoạn PKE2 được cất loại dung môi rồi đưa lên cột silica gel, giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (95:5) thu được hợp chất PK1 (120mg).

Phân đoạn 6 (PKE6) được tinh chế bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi giải hấp là MeOH thu được 10 phân đoạn, ký hiệu PKE6.1 → PKE6.10. Trong đó có hai phân đoạn chính là PKE6.6, PKE6.8. Tinh chế tiếp phân đoạn

PKE6.6 trên sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi giải hấp là MeOH thu được hợp chất PK3 (97mg) và phân đoạn PKE6.8 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi giải hấp là CH2Cl2-MeOH (9:1) thu được hợp chất PK4 (70mg).

Phân đoạn 3 (PKE3), phân đoạn 4 (PKE4) đều thấy xuất hiện kết tinh màu vàng trong hỗn hợp dung môi CH2Cl2-MeOH. Lọc kết tinh và rửa với CH2Cl2 thu được hợp chất PK5 (70mg) từ phân đoạn PKE4 và hợp chất PK6 (50mg) từ phân đoạn PKE3.

Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết EtOAc của rễ Thông lá dẹt được biểu diễn ở Sơ đồ 3.2.

Cặn chiết EtOAc (60g)

CC, SiO2

1. n-hexane-CH2Cl2 (80:20 → 10:90)

2. CH2Cl2-MeOH (98:2 →90:10)