Khử Hoá Nối Đôi  20(29) Của Betulinic Acid [65], [66]

Sơ đồ 1.8. Chuyển hóa các dẫn xuất carbamate của betulin [65]

1.4.2. Chuyển hoá nhóm isopropenyl

Có thể bạn quan tâm!

Chuyển hóa ở nối đôi 20(29) ở nhóm isopropenyl của một số triterpene khung lupane cũng đã được quan tâm nghiên cứu nhiều nhằm tạo ra các hợp chất mới có hoạt tính sinh học thú vị.

1.4.2.1. Khử hoá nối đôi 20(29)

Phản ứng khử hoá nối đôi này của betulinic acid được thực hiện dưới áp suất khí H2 với xúc tác Pd-C để cho dihydrobetulinic acid (80) (Sơ đồ 1.9). Trong một nghiên cứu, Fumio Hashimoto và các cộng sự đã chỉ ra 80 và một số dẫn xuất của nó có cũng có khả năng chống được HIV [65], [66].

Sơ đồ 1.9: Khử hoá nối đôi  20(29) của betulinic acid [65], [66]

1.4.2.2. Oxy hoá nối đôi 20(29)

Để phản ứng này chỉ xảy ra ở nối đôi 20(29) thì trước khi tiến hành cần phải bảo vệ nhóm 3β-OH khỏi tác nhân oxi hóa bằng cách acetyl hóa nhóm OH này (56.1). Hợp chất 56.1 có thể bị oxy hoá bởi SeO2 cho aldehyde 81 hoặc bởi ozone cho ketone 83. Sau đó sản phẩm aldehyde lại được khử về ancol 82. Trong số này các dẫn xuất 81, 82 đã được phát hiện có hoạt tính chống viêm và kìm hãm sự phát triển của khối u [67], [68].

Sơ đồ 1.10. Oxi hóa nối đôi  20(29) của betulinic acid [67], [68]

1.4.2.3. Chuyển hoá ở vị trí allyl của nối đôi

Trong một nghiên cứu công bố năm 2011, Keduo Qian và các cộng sự đã tổng hợp được một số dẫn xuất mới của betulinic acid (Sơ đồ 1.11) và nghiên cứu về khả năng ức chế proteasome của chúng hay nói cách khác là khả năng ức chế khối u bằng cách ngăn chặn sự phát triển của tế bào [69], [70]. Kết quả cho thấy, hai dẫn xuất 86, 87 có khả năng ức chế proteasome mạnh với IC50 tương ứng là 1,56 và 1,80μM, gấp 3 đến 4 lần so với những hợp chất ức chế proteasome đã được biết đến là Ac-Leu-Leu-Met-CHO (LLM-F) và lactacystin.

COOH

OMe

1. CO2Cl2N

2. Leucine methyl este

AcO

56.1

AcO

NBS/acetonitrile

1. Nucleophilic/NaH, THF

2. MeOH–H2O

AcO

O O

OMe

H H

N N

AcO

86: R =

O(H2C)2 Br

87: R = O(H2C)2 Cl

Sơ đồ 1.11. Chuyển hóa vị trí allyl của nối đôi tạo hợp chất 85- 87 [69], [70]

1.4.3. Chuyển hóa nhóm 28-COOH

Chuyển hoá ở nhóm 28-COOH được đặc biệt quan tâm và là chuyển hoá chính với số lượng dẫn xuất nhiều hơn cả. Các sản phẩm thu được của quá trình chuyển hóa ở nhóm 28-COOH có thể là este hoặc amide.

1.4.3.1. Chuyển hóa thành ester

Yibi và các cộng sự khi tiến hành nghiên cứu rễ loài Pulsatilla chinensis, một loài cây thuốc dùng để điều trị các bệnh như sốt rét, lỵ amip, cai nghiện…trong y học cổ truyền Trung Quốc, đã phân lập được hợp chất 23-hydroxy betulinic acid

(88) - chất này có khả năng chống ung thư, HIV rất tốt, thậm chí còn cao hơn cả betulinic acid ở dòng tế bào ung thư phổi. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp một số dẫn xuất este hóa ở vị trí 28-COOH của nó (92.(1-6)) (Sơ đồ 1. 12) và nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của chúng [71]. Kết quả cho thấy, tất cả các dẫn xuất này đều có hoạt tính mạnh hơn so với chất ban đầu trên 5 dòng tế bào ung thư gồm ung thư phổi A-549, ung thư hắc tố da B16, ung thư não SF-763, ung thư

gan BEL-7402 và ung thư thần kinh chuột C6, đặc biệt hợp chất 92.1 còn có khả năng ức chế tế bào ung thư gan H22 ở chuột tương tự với cyclophosphamide.

Sơ đồ 1.12. Tổng hợp một số dẫn xuất ester của 23-hydroxy betulinic acid [71]

1.4.3.2. Chuyển hóa thành amide

Đây là hướng phản ứng chính được sử dụng để chuyển hóa nhóm 28-COOH. Những dẫn xuất amide này thường mang đến những hoạt tính lý thú hơn so với các hợp chất ban đầu và đang nổi lên như là một lớp chất mới có tác dụng ức chế đặc biệt chống lại virus HIV-1 theo phương thức hoàn toàn mới [72], [73].

Năm 1994, Mayaux và Bouseau đã đăng ký bản quyền cho một chất kháng HIV kí hiệu là RPR 103611 (93) cũng là một dẫn xuất amide của betulinic acid ở C- 28 [74].

Trong một công bố năm 2008, Weihong Lai và cộng sự đã đưa ra dẫn xuất amide của betulinic acid là A43-D (96) được tổng hợp theo Sơ đồ 1.13 có khả năng

chống HIV-1 rất cao [75].

Sơ đồ 1.13. Tổng hợp dẫn xuất A43-D của betulinic acid [75]

CHƯƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu

 Mẫu rễ cây Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) được thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam vào tháng 8 năm 2012. Tên khoa học do TS. Nguyễn Tiến Hiệp – Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định. Tiêu bản số CPC-4711 được giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

 Mẫu cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) được thu hái ở Mai Châu, Tỉnh Hòa Bình, Việt Nam vào tháng 10 năm 2009. Tên khoa học do CN. Ngô Văn Trại, Viện Dược liệu, Bộ Y tế xác định. Tiêu bản được giữ tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.2. Hóa chất

 Sắc ký lớp mỏng phân tích: Sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60F254, có độ dày 0,2 mm. Sắc ký cột thường: silica gel cỡ hạt 197 – 400 mesh (0,040 – 0,063 mm) cho cột đầu. Sắc ký cột nhanh: silica gel cỡ hạt 70 – 200 mesh cho cột tiếp theo. Sắc ký cột pha đảo: RP-18. Sắc ký lọc gel: Sephadex LH-20 Merck. Dung môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH được cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng.

 Các hóa chất dùng cho quá trình tổng hợp hữu cơ của hãng Merck (CHLB

Đức) hoặc Aldrich (Mỹ).

2.1.3. Thiết bị

 Phổ hồng ngoại FT-IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy IMPACT- 410, Nicolet-Carl Zeiss Jena (Đức) tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 [499,84 MHz (1H-) và 125 MHz (13C-); TMS (δ = 0,0); CD3OD (δ = 49,0); CDCl3 (δ = 77,0)] tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy Varian Unity 300 [300 MHz (1H-) và 75 MHz (13C-); TMS (δ = 0,0); CD3OD (δ = 49,0); CDCl3 (δ = 77,0)] tại Viện Sinh hóa Thực vật Halle, CHLB Đức.

 Phổ khối ESI-MS được đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AMD 402 (Đức).

 Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS Varian (USA), tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

 Sắc ký khí gắn khối phổ GC/MS được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC/MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N tại Phòng thí nghiệm trọng điểm, khoa Hóa học, ĐH Vinh, Nghệ An. Thiết bị Agilent Technologies HP 6890N ghép nối khối phổ (Mass Selective Detector Agilent HP 5973 MSD). Cột HP-5MS có kích thước 0,25m x 30m x 0,25mm và HP1 có kích thước 0,25m x 30m x 0,32mm. Xác nhận các cấu tử được thực hiện bằng cách so sánh các dữ kiện phổ MS của chúng với phổ chuẩn đã được công bố có trong thư viện Willey/Chemstation HP.

 Điểm chảy được đo bằng máy đo điểm chảy VEB Analytik Dresden HMK 73/4470 (Đức), Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

 Năng suất quay cực được đo trên thiết bị Jasco P-2000 Polarimeter serial A060161232, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp chiết tách

2.2.1.1 Phương pháp chiết tách các chất từ loài Thông lá dẹt

Mẫu thực vật được làm sạch các tạp chất cơ học, sấy khô ở nhiệt độ 40-500C,

xay nhỏ và ngâm chiết bốn lần bằng hỗn hợp dung môi MeOH - H2O (80:20) ở nhiệt độ

phòng.

Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất thấp, dịch nước còn lại được chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, EtOAc, n-BuOH bằng phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng. Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các cặn chiết n-hexane, EtOAc, n-BuOH tương ứng.

Cặn chiết n-hexane được xác định thành phần hóa học bằng phương pháp GC-MS.

Cặn chiết EtOAc và n-BuOH được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau như: silica gel, RP-18, sephadex LH-20 với các hệ dung môi thích hợp.

2.2.1.2. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Ngũ gia bì hương

Mẫu thực vật được làm sạch khỏi các tạp chất cơ học, sấy khô ở nhiệt độ 400C, xay nhỏ và ngâm chiết bốn lần bằng hỗn hợp dung môi MeOH-H2O (85:15) ở nhiệt độ phòng.

Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất thấp, dịch nước còn lại được chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, CH2Cl2 bằng phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng. Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các cặn chiết n-hexane, ATC1 tương ứng.

Dịch nước còn lại được thủy phân với NaOH 4N trong ethanol ở 80oC trong 8 giờ. Sau đó, hỗn hợp sản phẩm được trung hòa với HCl 1N và chiết với CH2Cl2. Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn chiết ATC2.

Phân lập cặn chiết ATC1, ATC2 thu được bằng phương pháp sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau như: silica gel, RP-18 với các hệ dung môi thích hợp.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC,