Phương Pháp Xác Định Cấu Trúc Hóa Học Của Các Chất

Chương 2

THỰC NGHIỆM

2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu

+ Vỏ và rễ cây cọ hạ long, thu hái vào tháng 6 năm 2009 tại Vịnh Hạ Long. Tên cây do TS. Trần Thị Phương Anh, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định. Tiêu bản số LH01/2009 được lưu tại Viện Hóa học (Phòng Tổng hợp hữu cơ).

+ Cây rau má được thu hái vào tháng 8 năm 2010 tại Ba vì Hà nội. Tên cây do cử nhân Ngô Văn Trại và thạc sĩ Nguyễn Thế Anh đồng thời có sự giúp đỡ của TS. Trần Thị Phương Anh xác định, có so sánh với mẫu đang lưu tại phòng Tiêu bản thực vật, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội. Tiêu bản số RM01/2010 được lưu giữ tại phòng Tổng hợp hữu cơ, viện Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Mẫu thực vật được phơi khô trong bóng râm, hoặc sấy ở 45 oC trong tủ

sấy, để nguội, xay nhỏ và chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 129 trang tài liệu này.

như n-hexan, diclometan, metanol.

2.1.2. Dung môi, hóa chất

+ Các dung môi được sử dụng để chiết tách và tinh chế là: n-hexan,

etylaxetat, diclometan, metanol được cất lại qua cột trước khi dùng.

+ Chất hấp phụ silicagel có cỡ hạt 0,063 mm, pha đảo RP18 và Sephadex LH20 dùng để chạy cột được mua của hãng Merck CHLB Đức và Aldrich, Hoa Kì.

+ Bản mỏng tráng sẵn trên nhôm với silicagel G60 có chất huỳnh quang F254 của hãng Merck được dùng để kiểm tra quá trình tách trên cột và cũng như độ tinh khiết của chất tách được.

2.1.3. Thiết bị thí nghiệm

- Phổ hồng ngoại (FT-IR) được đo dưới dạng viên nén KBr trên máy quang phổ hồng ngoại IMPACT 410-NICOLET (Mỹ) của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Phổ khối ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LC/MSD Agilent series 1100 của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với TMS là chất chuẩn nội cho 1H- và tín hiệu dung môi làm chuẩn cho 13C-NMR.

- Độ quay cực [α]D được đo trên máy JASCO P2000 Polarimeter tại Viện Hóa Sinh biển – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp điều chế các phân đoạn

Vỏ và rễ của cây cọ hạ long và cây rau má phần trên mặt đất sau khi đã sấy khô và xay nhỏ được cân chính xác và chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau theo hai cách:

+ Cách thứ nhất: Ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng, rút dịch chiết và thêm dung môi mới 3 lần, mỗi lần ngâm 4 giờ. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45-50 0C (bằng máy quay cất chân không). Cao thu được được chế thêm nước cất. Sau đó chiết lần lượt với n-hexan, diclometan. Các dịch chiết được cất loại dung môi cho đến khi khô sẽ thu được các cao chiết tương ứng để nghiên cứu tiếp.

+ Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với các loại dung môi n-hexan, diclometan và metanol ở nhiệt độ phòng. Với mỗi loại dung môi được rút dịch chiết và thêm dung môi mới ba lần. Mỗi lần ngâm ba tiếng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45-50 0C cho tới khô (sử dụng

máy quay cất chân không) sẽ thu được các cao chiết tương ứng để nghiên cứu tiếp.

2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất

Các cao chiết trong các dung môi khác nhau được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp. Sắc kí cột (SKC) gồm sắc kí cột thường và sắc kí cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel. Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH20 hoặc pha đảo RP18. Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như kiểm tra quá trình chạy cột bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) với nhiều hệ dung môi khác nhau để xác định Rf tối ưu (Rf 0,4-0,6).

2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất

Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR). Trong trường hợp cần thiết sẽ điều chế dẫn xuất axetyl của những chất chứa nhóm hydroxyl để khẳng định thêm cấu trúc của chúng.

2.2.4. Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

2.2.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

* Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định : Vi khuẩn gram (-):

+ Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442,

+ Escherichia coli (Ec) ATCC 25922

+ Salmonella enterica (Se) Vi khuẩn gram (+):

+ Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709.

+ Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633

+ Lactobacillus fermentum N4

Và nấm:

+ Candida albicans (Ca) ATCC 10198.

* Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller- Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm.

* Phương pháp: Phương pháp pha loãng nồng độ

- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.

- Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 10 nồng

độ).

- Mẫu ban đầu có nồng độ 40 mg/ml được pha loãng thành các nồng độ

khác nhau để thử hoạt tính với các chủng: 256; 64; 16; 4 và 1 g/ml.

- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến hành thử.

- Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200

l dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ ở 37 0C. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data.

* Chất đối chứng

- Kháng sinh Ampicilin cho các chủng vi khuẩn gram (+) và chủng vi khuẩn gram (-) Ec với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 – 2 g/ml.

- Hỗn hợp kháng sinh Pen/Step cho chủng vi khuẩn gram (-) Pa với giá

trị IC50 trong khoảng 4 – 5 g/ml.

- Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5 – 1 g/ml.

2.2.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào

* Các dòng tế bào: các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC, gồm có:

- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô – là dòng luôn

được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào.

- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) – ung thư gan.

- LU (Human lung carcinoma) – ung thư phổi.

- MCF – 7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú.

* Phương pháp: phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.

- Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37 0C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau.

* Thử độc tế bào:

- Cho 200 l dung dịch tế bào ở pha lỏng nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB; môi trường DMEM cho LU-1.

- Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml. Ủ trong điều kiện 37 0C, 5% CO2 trong 3 ngày.

- Giếng điều khiển gồm 200 l dung dịch tế bào nồng độ 3.104 tế

bào/ml, ủ ở 37 0C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50 l MTT (1 mg/ml pha

trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 37 0C 4 giờ.

- Loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

* Tính kết quả:

GI%: Phần trăm kìm hãm sự phát triển ( Growth Inhibition).

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả GI% của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.

2.2.4.3. Hoạt tính chống oxy hóa

* Phương pháp thử hoạt tính DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng  = 517 nm.

Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong methanol (MeOH). Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 37 0C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bước sóng 517 nm. % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:

SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%).

EC50 (nồng độ có hiệu lực với 50% cá thể) được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.

Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang:

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH

1.8000

1.6000

1.4000

1.2000

1.0000

y = 0.3225x + 0.0241

R2 = 0.9938

0.8000

0.6000

0.4000

0.2000

0.0000

0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000

Nồng độ DPPH mM

Mật độ quang học (OD)

* Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza

Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC (Adenine dextrose citrate), pha loãng 10-20 lần bằng nước cất. Chia thành các ống nhỏ 0,5-1 ml. Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh -80oC. Khi dùng pha loãng thêm 25- 50 lần bằng RB.

H2O2 (0,2 N hay 2%).

Indigocarmin: chuẩn bị dung dịch stock-80 0C: 0,1 N, pha loãng 100 lần sẽ thu được dung dịch phản ứng 0,001 N.

Chất thử:

-Pha loãng bằng DMSO: dịch gốc 20 mg/ml, tiếp theo pha loãng 1:4 tạo thành 1 dãy 5 nồng độ.

-Pha loãng bằng dung dịch đệm: tạo một dãy 5 nồng độ mới từ dãy nồng độ trên bằng cách pha loãng 7,8 lần với dung dịch đệm.

Phản ứng:

 50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1 N

 10 l chất thử pha trong DMSO và RB

 60 l enzyme pha loãng 500 lần

 60 l H2O2 0,2N hay 2%

 20 l Indigocarmin 0,001 N

 50 l TCA 20%

 Giếng điều khiển âm không có enzim, không có chất thử, giếng

điều khiển dương enzim hoạt động 100%, không có chất thử.

 Để thời gian phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 20-25 phút, dừng phản ứng bằng TCA. Đọc kết quả ở bước sóng 610 nm.

2.3. Phân lập các hợp chất từ cây cọ hạ long

2.3.1. Tách và tinh chế các chất từ vỏ cây cọ hạ long

3 kg vỏ tươi được sấy ở 450C, thu được 900 g khô, xay nhỏ và ngâm chiết với n-hexan (3 lần x 1,5 lít), sau đó tiếp tục chiết với CH2Cl2 (3 lần x 1,5 lít) và cuối cùng chiết bằng metanol 90% (3 lần x 1,5 lít), ở nhiệt độ phòng. Thời gian rút dịch chiết đối với mỗi loại dung môi là từ 3-6 giờ/lần. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt độ 50 0C, thu được 4,9 g cao n- hexan, 3,1 g cao diclometan và 24,9 g cao MeOH.

Từ các kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết n-hexan, CH2Cl2, MeOH và qua kiểm tra sắc ký bản mỏng các dịch chiết của vỏ cây cọ hạ long, chúng tôi tập trung phân lập các chất từ dịch chiết n-hexan.

2.3.1.1. Phân lập các chất từ cao chiết n-hexan (theo sơ đồ 2.1)

Phần cao chiết n-hexan được khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng và thuốc hiện là CeSO4. Sau khi thử nghiệm với các hệ dung môi khác nhau để tìm hệ dung môi thích hợp cho sắc ký cột, đã tìm thấy hệ dung môi phù hợp là n- hexan/EtOAc.

4,9 g cao chiết n-hexan được hòa tan vừa đủ bằng CH2Cl2 và trộn với 5 g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký.

Silicagel Merck (200 gam) được nhồi vào cột sắc ký có kích thước 2 cm

x 80 cm theo phương pháp nhồi ướt với hệ dung môi n-hexan/EtOAc = 98/2.