Tách Và Tinh Chế Các Chất Trong Rễ Cây Cọ Hạ Long (Theo Sơ Đồ 2.2)

Sau khi cột được nén bằng máy nén khí đã tương đối ổn định, bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên cột, và giải hấp với hệ dung môi rửa giải là n- hexan/EtOAc có độ phân cực tăng dần, thu được 6 phân đoạn chính.

- Phân đoạn 1 (250 mg) được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (n-hexan:EtOAc = 100:0 – 95:5) thu được 50 mg chất 68 (ký hiệu là: LHVn5a).

- Phân đoạn 2 (62 mg) được tinh chế lại trên cột sắc ký nhanh (SiO2, n- hexan:EtOAc = 98:2 – 90:10) thu được 30 mg chất 67 (ký hiệu là: LHVn6).

- Phân đoạn 3 (40 mg) được tinh chế lại trên cột sắc ký nhanh (SiO2, n- hexan:EtOAc = 98:2 – 90:10) thu được 28 mg chất 69 (ký hiệu là: LHVn4).

- Phân đoạn 4 (56 mg) được tinh chế lại trên cột SiO2 (n-hexan:EtOAc = 98:2 – 85:15) thu được 36 mg chất 70 (ký hiệu là: LHVn7).

- Phân đoạn 5 (360 mg) được kết tinh lại (n-hexan:EtOAc = 1:1) thu

được 50 mg chất 71 (ký hiệu là: CT1).

- Phân đoạn 6 (1260 mg) được kết tinh lại (n-hexan:EtOAc = 1:1) thu

được 650 mg chất 72 (ký hiệu là: LHVH2).

Có thể bạn quan tâm!

• Đặc Điểm Thực Vật Và Ứng Dụng
• Methyl 5-[(E)-9-Hydroxy-1(1-Hydroxyhexeyl)-2-Metoxyundeca- 3,10-Dien-5,7-Diynyloxy] Pentanoat
• Phương Pháp Xác Định Cấu Trúc Hóa Học Của Các Chất
• Β -Sitosterol-3- O- Β –D -Glucopyranosid ( Β -Sitosterol Glucosid), (Lhrm3)
• Số Liệu Phổ Của Các Chất Phân Lập Được Từ Cây Rau Má
• Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis T.H. Nguyen & Kiew) và cây rau má [Centella asiatica(Linn.) Urban] - 9

Xem toàn bộ 129 trang tài liệu này.

Mẫu vỏ cọ khô xay nhỏ (900 g)

1.Chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, CH2Cl2 và MeOH

2. Cô đuổi dung môi

3,1 g

cao CH2Cl2

(LHVd)

4,9 g

cao n-hexan

(LHVn)

24,9 g

cao MeOH

(LHVm)

SKC silicagel: n-hexan/ EtOAc (98:2 -- 70:30)

Pđ 1

250 mg

Pđ 2

62 mg

Pđ 3

40 mg

Pđ4

56 mg

Pđ5

360 mg

Pđ6

1260 mg

SKC silicagel: n-hexan/ EtOAc (98:2 -- 85:15)

Kết tinh: n-hexan/ EtOAc (1:1)

LHVn6

30 mg

68

LHVn5a

30 mg

67

LHVn4

28 mg

69

LHVn7

36 mg

70

CT1

50 mg

71

LHVH2

650 mg

72

Sơ đồ 2.1. Phân lập các chất từ vỏ cây cọ hạ long(L. halongensis)

Từ cao chiết n-hexan của vỏ cây cọ hạ long đã phân lập được 6 chất sạch, bao gồm:

2.3.1.2. Số liệu phổ các chất tách từ cao chiết n-hexan của vỏ cây cọ hạ long

*). Chất 67 (LHVn6): Cyclomusalenon

- Phổ IR (KBr) max (cm-1): 3067 (=CH2), 3030 (cyclopropyl); 2930, 2867

(CH2, CH3); 1712 (C=O); 1640 (=CH2); 1457, 1373, 1097, 885 (=CH2).

- Phổ khối phân giải cao ESI-MS, ion dương; m/z = 425,38076 [M + H]+; M

= 424 (C30H48O).

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,32 (1H, d, J = 3,8 Hz,

H-19A); 0,55 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19B); 0,80 ( 3H, d, J = 6,4 Hz, CH3-21);

0,92 (3H, s, CH3-29); 0,92 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3-30); 0,93 (3H, d, J = 6,2

Hz, CH3-28); 0,99 (3H, s, CH3-18); 1,57 (3H, s, CH3-27); 2,32-2,36 (2H, m, H-2); 4,60 (2H, s, H2-26).

- Phổ 13C-NMR: xem bảng 3.1.

*). Chất 68 (LHVn5a): Cycloleucadenon

- Phổ IR (KBr) max (cm-1): 3072 (=CH2); 3030 (cyclopropyl); 2936, 2872

(CH2, CH3); 1715 (C=O); 1640 (=CH2); 1643, 1459, 1378, 1113, 890, (=CH2).

- Phổ khối phân giải cao ESI-MS: m/z = 439,39012 [M + H]+ (C31H51O); M

= 438 (C31H50O).

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,56 (1H, d, J = 3,9 Hz,

H-19A); 0,79 (1H, brs, H-19B); 0,91 (3H, s, CH3-29); 0,88 (3H, d, J = 7,1

Hz, CH3-21); 0,92 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-28); 0,99 (3H, s, CH3-18); 1,05

(3H, s, CH3-30); 1,10 (3H, s, CH3-31); 1,64 (3H, t, J = 4,1 Hz, CH3-27); 2,30

(1H, ddd, J = 2,6, 4,2, 14,0 Hz, H-2A); 2,70 (1H, dt, J = 6,4, 14,0 Hz, H-2B); 4,67 (br s, H2-26).

- Phổ 13C-NMR: xem bảng 3.2.

*). Chất 69 (LHVn4): 3β- Cyclomusalenol

- Phổ IR (KBr) max (cm-1): 3341 (OH); 3076 (=CH2), 3030 (cyclopropyl); 2926, 2876 (CH2, CH3); 1647, 1376, 1048, 887 (=CH2).

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,13 (1H, d, J = 3,9 Hz,

H-19A); 0,38 (1H, d, J = 2,9 Hz, H-6α); 0,53 (1H, d, J = 3,9Hz, H-19B); 0,58

(1H, d, J = 12,0 Hz, H6β); 0,86 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3-21); 0,88 (3H, s,

CH3-18); 0,99 (3H, d, J = 6,9 Hz, CH3-28); 0,96 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-30);

0,98 (3H, s, CH3-29); 1,64 (3H, s, CH3-27); 3,2 (1H, dt, J = 10,9, 4,8 Hz, H-

3α); 4,67 (2H, s, H2-26).

- Phổ 13C-NMR: xem bảng 3.3. Sự gán phổ dựa vào so sánh với phổ của 3β – cyclomusalenol, 3-epi-Cyclomusalenol và phổ 2D-NMR của chất 69.

*). Chất 70 (LHVn7): Stigmast-4-en-3-on

- Phổ IR (KBr) max (cm-1): 2969, 2926, 2869, 1678 (carbonyl liên hợp);

1615, 1646, 1378, 873.

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,71 (3H, s, CH3-18);

0,82 (3H, d, J = 6,7 Hz, CH3-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27); 0,86 (3H,

d, J = 7,4 Hz, CH3-21); 0,91 (3H, t, J = 6,3 Hz, CH3-29); 1,18 (3H, s, CH3-

19); 2,26 (1H, ddd, J = 2,4, 3,9, 14,5 Hz, H-2A); 5,72 (1H, br s, H-4).

- Phổ 13C-NMR: xem bảng 3.4.

*). Chất 71 (CT1): Stigmasterol

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,70 (3H, s, CH3-18);

0,79 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3-26); 0,80 (3H, t, J = 7,5 Hz, CH3-29); 0,84 (3H,

d, J = 6,4 Hz, CH3-27); 1,01 (3H, s, CH3-19); 1,02 (3H, d, J = 6,7 Hz CH3-

21); 3,51 (1H, m, H-3α); 5,02 (1H, dd, J = 8,7, 15,2 Hz, H-22); 5,16 (1H, dd,

J = 8,6, 15,2 Hz, H-23); 5,35 (d, J = 5,4 Hz, H-6).

- Phổ 13C-NMR (CD3Cl, 125 MHz)  (ppm): 37,3 (C-1), 31,7 (C-2), 71,8 (C- 3), 42,4 (C-4), 140,8 (C-5), 121,7 ( C-6), 31,9 (C-7), 31,9 (C-8), 50,2 (C-9),

36,6 (C-10), 21,1 (C-11), 39,7 (C-12), 42,3 (C-13), 56,9 (C-14), 25,4 (C-15),

28,9 (C-16), 56,0 (C-17), 12,2 (C-18), 19,0 (C-19), 40,5 (C-20), 19,4 (C-21),

138,3 (C-22), 129,3 (C-23), 51,3 (C-24), 31,9 (C- 25), 19,0 (C-26), 21,1 (C-

27), 25,4 (C-28), 12,2 (C-29).

- Phổ ESI-MS ion dương của chất 71 cho các pic tại m/z = 414,8 [M+2]+ và m/z = 395,8 [M+1-H2O], như vậy khối lượng phân tử của 71 là m/z = 412 phù hợp với công thức C29H48O.

*). Chất 72 (LHVH2): β-sitosterol

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,68 (3H, s, CH3-18);

0,77 (3H, d, J = 6,6 Hz, CH3-27); 0,84 (3H, d, J = 6,6 Hz, CH3-26); 0,85 (3H,

d, J = 7,0 Hz, CH3-21); 0,91 (3H, t, J = 6,4 Hz, CH3-29); 1,01 (3H, s, CH3-

19); 3,52 (1H, m, H-3α); 5,35 (1H, m, H-6).

*. Phản ứng khử 67 bằng NaBH4

Dựa vào số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 69 gợi ý chất 69 có cùng khung carbon với chất 67. Qua so sánh các tài liệu tham khảo, cho ta suy ra cấu trúc của chất 69 là 3β-cyclomusalenol. Để khẳng định thêm cấu trúc của chất 69 chúng tôi tiến hành khử hóa chất 67 với NaBH4 trong methanol với quy trình như sau:

0,05 mmol (22 mg) 67 được hòa trong MeOH (0,5 ml), 0,1 mmol (3,7 mg) NaBH4 được cho thêm vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng 4 giờ. Sau đó cho thêm 1,5 ml H2O, trung hòa bằng axit HCl (5%) tới pH = 4 và chiết với EtOAc. Sản phẩm được rửa với nước, làm khan với Na2SO4, cô cất dung môi dưới áp suất thấp, sau đó được tách bằng sắc ký cột silicagel trên với hệ dung môi n-hexan/ETOAC 1:1 thu được sản phẩm 69 (15 mg) và đồng phân 69a (5mg).

2.3.2. Tách và tinh chế các chất trong rễ cây cọ hạ long (theo sơ đồ 2.2)

2.3.2.1. Phân lập các chất có trong cao chiết rễ cây cọ hạ long

900 g rễ cây cọ hạ long đã được sấy khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết với n- hexan (3 lần x 1,5 lít), sau đó tiếp tục chiết với CH2Cl2 (3 lần x 1,5 lít) và cuối cùng chiết bằng metanol 90% (3 lần x 1,5 lít), ở nhiệt độ phòng. Thời gian rút dịch chiết đối với mỗi loại dung môi là từ 3-6 tiếng/lần. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt độ 50 0C thu được 2,1 g cao n–hexan; 2,0 g cao CH2Cl2 và 38 g cao MeOH.

*. Phân lập chất từ cao chiết n-hexan

Cao chiết n–hexan của rễ cây cọ hạ long (lấy 2,1 g) được tiến hành phân lập các chất theo phương pháp sắc kí cột trên chất hấp phụ là silicagel, dung môi rửa giải là hỗn hợp n–hexan:EtOAc với lượng EtOAc tăng dần 98:2 đến 70:30 thu được 6 phân đoạn, qua kiểm tra các phân đoạn trên sắc ký bản mỏng, ta chọn phân đoạn 4 để tinh chế chất sạch.

Phân đoạn 4 (150 mg) được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (n- hexan:EtOAc = 98:2) thu được 60 mg hỗn hợp gồm 2 chất chính có Rf gần trùng nhau không thể tách bằng sắc ký cột silicagel. Do đó chúng tôi thực hiện phản ứng axetyl hóa bằng anhydrit axetic trong pyridin, tinh chế trên cột sắc ký nhanh (SiO2, n-hexan:EtOAc = 100:0 - 95:5) thu được chất 73 sạch ký hiệu LHRn2 (10 mg) và chất 74 LHRn3 (15 mg).

*. Phân lập chất từ cao chiết MeOH

10 g cao chiết MeOH của rễ cây cọ hạ long được phân lập bằng phương pháp sắc kí cột trên chất hấp phụ là silicagel, dung môi rửa giải là CH2Cl2: MeOH với lượng MeOH tăng dần 98:2 đến 60:40, thu được 9 phân đoạn, kiểm tra các phân đoạn trên sắc ký bản mỏng, chọn các phân đoạn 4, 6, 9 để tinh chế tiếp, thu chất sạch:

- Phân đoạn 4 (660 mg) được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (CH2Cl2:EtOAc = 100:0 - 70:30) thu được 3 chất sạch là chất 75, 76 và 77 có ký hiệu lần lượt là : LHRm1 (40 mg), LHRm2 (30 mg), LHRm3 (25 mg).

- Phân đoạn 6 (100 mg) được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (n- EtOAc: MeOH = 100:0 - 80:20) thu được 32 mg chất 78 sạch, ký hiệu là: LHRm4

- Phân đoạn 9 (156 mg) được axetyl hoá bằng anhydrit axetic trong dung môi pyridin, tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (n-hexan:EtOAc = 100:0 - 80:20) thu được 40 mg chất 79 sạch, ký hiệu là: LHRm6.

Xem tất cả 129 trang.