Tên dụng cụ, thiết bị, mẫu mã, model | Xuất xứ | |
6. | Bình chiết 100 ml, 250 mL, 500 mL, 1000 mL, 2000 mL | Đức |
7. | Bình nón 100 mL, 250 mL, 500 mL | Đức |
8. | Bình chạy sắc ký Classchem 10 cm x 10 cm | Đức |
9. | Hệ phản ứng Chemglass 5 Lít | Mỹ |
10. | Bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI) | Mỹ |
11. | Bình lọc hút chân không Buchner và phễu lọc | Trung Quốc |
12. | Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10-2 g | Thụy Sĩ |
13. | Cân phân tích Mettler Toledo AB204S, độ nhạy 10-4 g | Thụy Sỹ |
14. | Cân phân tích Sartorius TE 214S, độ nhạy 10-4 g | Thụy Sĩ |
15. | Cốc có mỏ 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL | Đức |
16. | Cột sắc ký (dài 60 cm, đường kính 3 cm) | Đức |
17. | Đèn sấy hồng ngoại | Đức |
18. | Đèn soi UV sắc ký CN6 | Đức |
19. | Đĩa 96 giếng nhựa | Mỹ |
20. | Eppendorf | Mỹ |
21. | Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu | Nhật |
22. | Hệ thống ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Agilent 1290/6460 | Mỹ |
23. | Kim cong đầu tù | Việt Nam |
24. | Máy cất quay chân không Buchi R-210 | Thụy Sĩ |
25. | Máy cất quay chân không Buchi R-220 | Thụy Sĩ |
26. | Máy đo nhiệt động nóng chảy EZ-Melt | Mỹ |
27. | Máy đo pH Eutech 700 | Đức |
28. | Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV- 500 MHz | Mỹ |
29. | Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz Ascend | Mỹ |
30. | Máy đo phổ hồng ngoại Jasco FT/IR-6700 | Nhật |
31. | Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer | Mỹ |
32. | Máy đo phổ hồng ngoại Shimazhu | Nhật |
33. | Máy đo phổ khối lượng Agilent 1100 LC-MSD Trap | Mỹ |
34. | Máy đọc ELISA 96 giếng Biotek | Mỹ |
35. | Máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) | Mỹ |
36. | Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA | Đức |
37. | Máy lắc bập bênh Votex | Mỹ |
38. | Máy microplate reader | Mỹ |
39. | Nhiệt kế thủy ngân | Đức |
40. | Pipet chia vạch 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL | Đức |
41. | Sinh hàn hồi lưu | Đức |
42. | Thước kẹp điện tử capliper Mitutoyo, độ chia 0,01mm | Nhật Bản |
Có thể bạn quan tâm!
-
Các Nghiên Cứu Biến Đổi Khác Trên Chuỗi Bên Aryl -
Các Phương Pháp Hóa Học Cải Thiện Độ Tan Của Một -
Một Số Ví Dụ Các Dược Chất Chứa Nhóm Sulfat Để Tăng Độ Tan -
Phương Pháp Phân Tích Dẫn Chất Tiềm Năng Bằng Hplc -
Bán Tổng Hợp Các Dẫn Chất Mới Của Curcumin Hướng Cải Thiện Độ Tan Trong Nước Và Đánh Giá Tác Dụng Sinh Học Các Dẫn Chất Tổng Hợp Được -
Sơ Đồ Phản Ứng Tổng Hợp Ph7 Với Tác Nhân 2-Bromoethanol
Xem toàn bộ 442 trang tài liệu này.
Tên dụng cụ, thiết bị, mẫu mã, model | Xuất xứ | |
43. | Tủ ấm CO2 | Đức |
44. | Tủ sấy chân không WiseVen | Đức |
45. | Tủ sấy Memmert | Đức |
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Bán tổng hợp được một số dẫn chất mới của curcumin theo hướng cải thiện độ tan trong nước và thăm dò tác dụng sinh học của các dẫn chất mới tổng hợp được.
+ Bán tổng hợp một số dẫn chất mới của curcumin (xem chi tiết trên các Sơ đồ 2.1
– Sơ đồ 2.9). Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy.
+ Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất bán tổng hợp được.
+ Xác định sơ bộ độ tan của các dẫn chất bán tổng hợp được.
+ Thăm dò các hoạt tính sinh học của các dẫn chất mới tổng hợp được: tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư.
- Phân tích, lựa chọn một dẫn chất tiềm năng để nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm. Đánh giá một số đặc tính sinh dược học; chỉ tiêu chất lượng và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của dẫn chất tiềm năng.
+ Phân tích, lựa chọn dẫn chất tiềm năng.
+ Khảo sát các phản ứng và xây dựng được quy trình tổng hợp dẫn chất tiềm năng.
+ Đánh giá độ tinh khiết và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của dẫn chất tiềm năng thu được.
+ Đánh giá một số đặc tính sinh dược học dẫn chất tiềm năng: độ tan trong các môi
trường pH khác nhau và trị số phân bố dầu/nước log DpH.
- Đánh giá hoạt tính chống viêm in vivo và độc tính cấp của một dẫn chất tiềm năng
+ Thử hoạt tính chống viêm trên chuột theo đường bôi trên da.
+ Đánh giá độc tính cấp trên chuột.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp tổng hợp hóa học
Sử dụng các phản ứng cơ bản trong tổng hợp hữu cơ: Acyl hóa, alkyl hóa, phản ứng trung hòa acid-base, phản ứng thủy phân, sulfat hóa, phosphat hóa, sulfonat hóa để tổng hợp các dẫn chất mới chứa các nhóm chức thân nước của curcumin. 8 nhóm chức thân nước được sử dụng là: -COOH, -COONa, -SO3Na, -OH alcol, - OPO(OH)2, -OPO(ONa)2, -OSO3Na và acid amin.
2.3.1.1. Tổng hợp các dẫn chất acid carboxylic của curcumin và tạo muối natri carboxylat
Thực hiện phản ứng dựa trên phương pháp của Ohtsu (2002) tạo các sản phẩm alkyl hóa bằng cách sử dụng ester của acid monocloroacetic [119]. Tiếp theo, thủy phân các sản phẩm alkyl hóa tạo dẫn chất acid carboxylic, sau đó tạo muối natri carboxylat bằng NaHCO3 trong alcol [132]. Sơ đồ các phản ứng như sau (Sơ đồ 2.1):
Sơ đồ 2.1. Tổng hợp dẫn chất acid carboxylic của curcumin và tạo muối natri
carboxylat
2.3.1.2. Tổng hợp muối dinatri O,OƟ-bis(2-sulfonatoethyl)curcumin (PH5)
Tổng hợp muối dinatri O,OƟ-bis(2-sulfonatoethyl)curcumin (PH5) theo sơ đồ sau (Sơ đồ 2.2):
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng hợp muối dinatri O,OƟ-bis(2-sulfonatoethyl)curcumin (PH5)
2.3.1.3. Tổng hợp các dẫn chất hydroxyethyl của curcumin
Thực hiện phản ứng dựa trên phương pháp của Changtam (2010) [33] tạo dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)curcumin (PH6) và di-O-(2-hydroxyethyl)curcumin (PH7). Sơ đồ phản ứng như sau (Sơ đồ 2.3):
Sơ đồ 2.3. Tổng hợp các dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)curcumin (PH6) và di-O-(2-hydroxyethyl)curcumin (PH7)
2.3.1.4. Tổng hợp các dẫn chất mới của curcumin thông qua trung gian monohydroxyethylcurcumin (PH6)
- Bán tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-(glutaryloxy)ethyl)curcumin (PH8) bằng phản
ứng acyl hóa PH6 theo sơ đồ sau (Sơ đồ 2.4):
Sơ đồ 2.4. Sơ đồ tổng hợp mono-O-(2-(glutaryloxy)ethyl)curcumin (PH8)
- Bán tổng hợp các dẫn chất succinat của curcumin thông qua trung gian PH6 bằng phản ứng acyl hóa thu được dẫn chất mono-O-(2-(succinyloxy)ethyl)curcumin (PH9), sau đó, tạo muối với NaHCO3 thu được muối natri của mono-O-(2- (succinyloxy)ethyl)curcumin (PH10) theo sơ đồ sau (Sơ đồ 2.5):
Sơ đồ 2.5. Sơ đồ tổng hợp mono-O-(2-(succinyloxy)ethyl)curcumin (PH9) và muối
natri mono-O-(2-(succinyloxy)ethyl)curcumin (PH10)
- Tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (PH11) từ curcumin thông qua trung gian PH6, bằng cách ester monophosphat hóa PH6 theo quy trình chung tổng hợp từ alcol với acid phosphoric, xúc tác là amin bậc 3 trong acetonitril của Dueymes và cộng sự [44], hoặc với phosphoryl oxyclorid theo phương pháp của Sowa [162], sau đó thực hiện phản ứng với Na2CO3 để tạo muối natri của 2- (curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (PH12), sơ đồ như sau (Sơ đồ 2.6):
Sơ đồ 2.6. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất PH11 và tạo muối PH12
2.3.1.5. Tổng hợp các dẫn chất mới của của curcumin thông qua chất trung gian dihydroxyethylcurcumin (PH7)
- Thực hiện phản ứng sulfat hóa PH7 qua trung gian DCC để tổng hợp muối natri 2-(O-(2-hydroxyethyl)curcumin)ethyl sulfat (PH13) (Sơ đồ 2.7).
Sơ đồ 2.7. Sơ đồ phản ứng tổng hợp muối sulfat PH13 từ PH7
- Bán tổng hợp các các dẫn chất di-O-(2-(glutaryloxy)ethyl)curcumin (PH14)và di- O-(2-(succinyloxy)ethyl)curcumin (PH15) từ PH7 theo Sơ đồ 2.8 và Sơ đồ 2.9:
Sơ đồ 2.8. Sơ đồ phản ứng tổng hợp diester glutarat PH14 từ PH7
Sơ đồ 2.9. Sơ đồ tổng hợp các diester của di-O-(2-hydroxyethyl)curcumin
- Tổng hợp hợp di-O-(2-(ւ-valinoyloxy)ethyl)curcumin (PH16) từ curcumin thông qua các giai đoạn: tổng hợp PH7, sau đó tổng hợp hai chất trung gian N-Boc-valin (TG2) từ valin và ((((1E,6E)-3,5-dioxohepta-1,6-dien-1,7-diyl)bis(2-methoxy- 4,1-phenylen))bis(oxy))bis(ethan-2,1-diyl)bis(2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3- methylbutanoat) (TG3) bằng cách lai hóa TG2 với PH7; cuối cùng loại nhóm bảo vệ -NH2, sử dụng HClkhí trong ethanol để thu được PH16, sơ đồ các giai đoạn như sau (Sơ đồ 2.10):
Sơ đồ 2.10. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất lai hóa của PH7 với valin
Sử dụng các kỹ thuật cơ bản trong tổng hợp hữu cơ như: phương pháp chiết, kết tinh phân đoạn, lọc, cất, sắc ký,…. để tinh chế các dẫn chất tổng hợp được.
2.3.2. Các phương pháp đánh giá độ tinh khiết của các dẫn chất
- Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy.
- Phương pháp sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi khai triển thích hợp: Hệ A: CH2Cl2
: MeOH = 30 : 1; Hệ B: CH2Cl2 : MeOH = 20 : 1; Hệ C: CH2Cl2 : MeOH = 7 : 1;
Hệ D: CHCl3 : MeOH = 9 : 1; Hệ E: EtOAc : n-hexan = 7 : 3; Hệ G: n-butanol : acid acetic : nước = 6 : 2 : 2; Hệ H: n-butanol : acid acetic : nước = 9,0 : 2,0 : 2,5; Hệ I: CHCl3 : MeOH : acid acetic = 9,0 : 1,0 : 0,1.
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc các dẫn chất
Cấu trúc của sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối được khẳng định bằng các
phương pháp phân tích phổ [3], [8]:
Phổ hồng ngoại (IR): Phổ IR được đo trên máy đo phổ hồng ngoại Jasco FT/IR- 6700 (Nhật Bản) tại Phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Tương đương sinh học, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia; trên máy đo phổ hồng ngoại Shimazhu (Nhật Bản) tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và trên máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer (Mỹ) tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp ép viên với KBr.
Phổ khối lượng (MS): Phổ MS được đo trên máy đo phổ khối lượng LC-MS/MS Agilent 1290/6460 (Agilent, Mỹ) tại Phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Tương đương sinh học - Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia và trên máy đo phổ khối lượng Agilent 1100 LC-MSD Trap (Agilent, Mỹ) tại Viện Hoá Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam ở chế độ ESI-MS trong dung môi MeOH.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR; 13C-NMR; DEPT và các phổ hai chiều HSQC, HMBC): Được đo trên máy máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV- 500 MHz (Bruker, Đức) tại Viện Hoá Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam và tại Khoa hóa học - Trường Đại học khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng dung môi hoà tan thích hợp như DMSO-d6, D2O, CD3OD, CDCl3 với chất chuẩn nội là tetramethylsilan (TMS).
2.3.4. Phương pháp thử độ tan của các dẫn chất
Độ tan của các dẫn chất trong nước tại 25±2 oC và áp suất khí quyển được xác định gián tiếp theo phương pháp của W. Yang và cộng sự [182] và hướng dẫn trong Dược điển Việt Nam V [4]:
Tiến hành: Cho một lượng chất tan quá bão hòa vào 10,0 ml nước trong bình nón ở 25±2 oC, và áp suất khí quyển. Siêu âm không sinh nhiệt bình nón trong 30 phút, cách 5 phút lắc 30 giây. Để hỗn hợp trong 2 giờ, lọc dung dịch qua màng lọc kích thước lỗ xốp 0,45 µm. Hút 5,0 mL dịch trong vào một cốc có mỏ có khối lượng m1
(mg) (đã sấy đến khối lượng không đổi). Bốc hơi hoàn toàn dung môi nước, sấy ở 70oC đến khối lượng không đổi. Cân lại tổng khối lượng m2 (mg) của cốc và sản phẩm. Độ tan trong nước S (tại 25±2 oC, áp suất khí quyển) của các chất được tính theo công thức sau:
Trong đó:
𝑆 = 𝑚2−𝑚1 (mg/mL)
5
S: độ tan trong nước của dẫn chất (mg/mL) m1: Khối lượng cốc ban đầu (mg)
m2: Khối lượng cốc và chất tan sau khi bốc hơi hoàn toàn (mg)
Các thí nghiệm cho mỗi mẫu được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Độ tan
được biểu thị như bảng sau:
Bảng 2.3. Bảng phân loại độ tan một chất theo Dược điển Việt Nam V
Số ml dung môi hòa tan 1g chất thử | Số mg chất thử tan trong 1mL dung môi | |
Rất tan | Dưới 1 | Trên 1000 |
Dễ tan | Từ 1 đến 10 | Từ 100 đến 1000 |
Tan | Trên 10 đến 30 | Từ 33,33 đến 100 |
Hơi tan | Trên 30 đến 100 | Từ 10 đến 33,33 |
Khó tan | Trên 100 đến 1000 | Từ 1 đến 10 |
Rất khó tan | Trên 1000 đển 10000 | Từ 0,1 đến 1 |
Thực tế không tan | Trên 10000 | Dưới 0,1 |
2.3.5. Phương pháp đánh giá một số đặc tính sinh dược học của dẫn chất tiềm
năng
2.3.5.1. Đánh giá độ tan in vitro của dẫn chất tiềm năng
Đánh giá độ tan của dẫn chất tiềm năng trong các môi trường pH khác nhau, tại 25±2 oC và áp suất khí quyển được thực hiện tương tự tại Mục 2.3.4 với các môi trường pH khác nhau: pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8; pH 7,4.
+ Môi trường pH 1,2: Trộn 50 mL dung dịch KCl 0,2 M với 85 mL HCl 0,2 M,
thêm nước vừa đủ 200 mL [173].
+ Môi trường đệm acetat pH 4,5: Hòa tan 63 g natri acetat khan trong nước, thêm 90 mL dung dịch acid acetic 5 M, chỉnh đến pH 4,5 và thêm nước vừa đủ 1000 mL.
+ Môi trường đệm phosphat pH 6,8: Trộn 50 mL dung dịch KH2PO4 0,2 M với 23,65 mL dung dịch NaOH 0,2N, thêm nước vừa đủ 200 mL.