Phương Pháp Phân Tích Dẫn Chất Tiềm Năng Bằng Hplc

+ Môi trường đệm phosphat pH 7,4: Trộn 50 mL dung dịch KH2PO4 0,2 M với 39,5 mL dung dịch NaOH 0,2N, thêm nước vừa đủ 200 mL [4].

2.3.5.2. Phương pháp phân tích dẫn chất tiềm năng bằng HPLC

Điều kiện sắc ký: Thông qua tham khảo các tài liệu của Singh và cộng sự (2010) [158], Wichitnithad và cộng sự (2011) [179] và Dương Thị Hồng Ánh (2017) [2] kết hợp khảo sát sơ bộ, dựa trên điều kiện trang thiết bị hiện có, các điều kiện chạy sắc ký được lựa chọn trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu như sau:

- Cột sắc ký: phenomenex C18; 150 x 4,6 mm; 5 µm

- Bảo vệ cột C18; 4 x 3 mm

- Nhiệt độ cột 40 °C

- Pha động: Acetonitril : acid acetic 0,2 % = 50 : 50

- Tốc độ dòng 1,5 mL/ phút

- Thể tích tiêm: 20 µL

- Nhiệt độ autosampler 4 °C

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 442 trang tài liệu này.

- Detector PAD, λ = 424 nm

2.3.5.3. Đánh giá hệ số phân bố log DpH của dẫn chất tiềm năng

Hệ số phân bố (partition coefficient - log P), có thể được đo bằng cách xác định sự phân bố của một chất giữa dung môi hữu cơ, thường là n-octanol bão hòa với nước và pha nước ở trạng thái cân bằng. Giá trị log P của một chất là giá trị logarit của tỷ số nồng độ chất đó ở dạng không ion hóa trong dung môi n-octanol và nước ở trạng thái cân bằng:

Trong đó:

Log P = Log 𝑪𝒏−𝒐𝒄𝒕𝒂𝒏𝒐𝒍

𝑪𝒏ướ𝒄

octanol

𝐶𝑛−𝑜𝑐𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙: Nồng độ của chất tan dạng không ion hóa trong dung môi n-

𝐶𝑛ướ𝑐: Nồng độ của chất tan dạng không ion hóa trong nước ở trạng thái cân bằng [55].

Tuy nhiên, nếu thuốc có nhiều hơn một trung tâm ion hóa, sự phân bố sẽ phụ thuộc vào pH. Do đó, nồng độ của thuốc bị ion hóa trong pha nước sẽ có ảnh hưởng đến hệ số phân vùng quan sát được tổng thể. Điều này dẫn đến định nghĩa hệ số phân bố theo pH (log DpH) của một hợp chất, trong đó có tính đến sự phân ly của acid và base yếu. log DpH, được định nghĩa là giá trị logarit của tỷ số nồng độ chất đó trong

pha hữu cơ (n-octanol) và nồng độ của chất đó ở dạng phân tử và dạng ion hóa trong

pha nước có pH khác nhau khi đạt trạng thái cân bằng:

Log DpH = Log 𝑪𝒏−𝒐𝒄𝒕𝒂𝒏𝒐𝒍

𝑪𝒏ướ𝒄

Trong đó:

𝐶𝑛−𝑜𝑐𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙: Nồng độ của chất tan dạng phân tử trong dung môi n-octanol

𝐶𝑛ướ𝑐: Tổng nồng độ chất tan ở dạng ion hóa và dạng phân tử trong pha nước ở các pH khác nhau ở trạng thái cân bằng [21], [55].

Giá trị log P và log DpH được xác định bằng phương pháp lắc (shake flask method). Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp để đánh giá các chất có giá trị log DpH trong khoảng từ -2 đến 4. Phương pháp được thực hiện như sau [21], [122]:

* Chuẩn bị dung môi: Đánh giá hệ số phân bố log DpH được thực hiện tại hai pha dầu (n-octanol) và pha nước: là 5 dung dịch môi trường: nước cất, đệm pH 1,2; đệm pH 4,5; đệm pH 6,8; đệm pH 7,4.

+ Chuẩn bị pha n-octanol bão hòa nước: Chuẩn bị 5 ống nghiệm chứa 20 mL n- octanol; thêm 5 mL pha nước tại các pH vào từng ống nghiệm. Tiến hành lắc liên tục hỗn hợp trên trong 24 giờ, ở 25±2 oC. Tiếp tục để cân bằng trong 12 giờ để tách pha. Thu lấy các phần n-octanol bão hòa nước ở các pH khác nhau.

+ Chuẩn bị pha nước bão hòa n-octanol: Chuẩn bị 5 ống nghiệm chứa 20 mL các dung dịch nước tại các pH khác nhau; thêm 5 mL n-octanol vào từng ống nghiệm. Tiến hành lắc như trên và để tách pha, thu được các phần nước tại các pH khác nhau bão hòa n-octanol.

* Chuẩn bị dung dịch hoạt chất trong pha nước: hòa tan lượng chất cần đánh giá trong các pha nước ở pH khác nhau đã bão hòa n-octanol sao cho tan được hoàn toàn trong dung dịch nước (lọc lại bằng màng lọc 0,45µm). Xác định diện tích pic chất phân tích tại pha nước (S1) theo phương pháp tại Mục 2.3.5.2.

*Tiến hành xác định hệ số log DpH theo phương pháp lắc: phối hợp 5 mL dung dịch chất cần đánh giá trong pha nước (pha bước trên) vào 5 mL n-octanol bão hòa pha nước tương ứng, khuấy với tốc độ 150 vòng/ phút, liên tục trong 2 giờ ở 25±2 oC. Để cân bằng 2 pha ở 24 giờ, 25 ±2 oC. Sau đó tách 2 pha. Phân tích lại chất cần phân tích còn trong pha nước (hoặc n-octanol), tính diện tích pic (S2) theo phương pháp tại Mục 2.3.5.2 và tính giá trị log DpH theo công thức:

Trong đó:

log DpH = Log 𝑺𝟏−𝑺𝟐

𝑺𝟐

S1: Tổng nồng độ chất dạng phân tử và ion hóa trong nước ở pH khác nhau

S2: Tổng nồng độ chất dạng phân tử và ion hóa còn lại trong pha nước ở pH khác nhau ở trạng thái cân bằng sau khi lắc với n-octanol.

2.3.6. Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học của các dẫn chất

2.3.6.1. Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp của Brand- Williams và cộng sự (1995) [32], Kedare và cộng sự (2011) [82], Yuvaraj và cộng sự (2013) [184] có chỉnh sửa cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm:

Mẫu thử được pha thành dung dịch gốc trong DMSO, sau đó được pha thành dải nồng độ phù hợp với nước cất khử ion. Acid ascorbic được sử dụng làm đối chứng tham khảo và cǜng được pha thành dải nồng độ phù hợp với nước cất khử ion. DPPH pha trong methanol (100 %) nồng độ 0,25 µM.

Hút mẫu nghiên cứu (100 µL) đã pha ở các nồng độ (tùy vào mẫu nghiên cứu) vào các giếng của đĩa 96. Thêm dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các giếng đã có sẵn mẫu nghiên cứu (tỉ lệ 1:1). Ống không có mẫu thử chỉ có 100 µL nước và 100 µL DPPH. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm. Vì mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH được đưa vào ống theo tỷ lệ 1 : 1, nên nồng độ mẫu nghiên cứu trong ống có DPPH sẽ giảm đi một nửa và nồng độ acid ascorbic trong ống có DPPH sẽ giảm đi một nửa. Ống có dung môi hòa mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH được xem là đối chứng. Ống có sử dụng acid ascorbic là chất đối chứng tham khảo.

Khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do (Scavenging Activity, SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:

% SA = (ODđối chứng – ODmẫu thử)*100/ODđối chứng (%) Trong đó: ODđối chứng : Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử ODmẫu thử : Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử

Giá trị SC50 (Scavenging Concentration at 50 % - nồng độ trung hòa được 50 % gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

2.3.6.2. Thử hoạt tính chống viêm thông qua ức chế sinh NO

Hoạt tính chống viêm thông qua ức chế sinh NO được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp của Combet và cộng sự (2000) [37], Cheenpracha và cộng sự (2010) [34] có chỉnh sửa cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm.

- Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

Dòng tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, và 1,0 mM natri pyruvat, ngoài ra bổ sung 10 % FBS. Tế bào được cấy chuyển sau 3–5 ngày với tỉ lệ (1 : 3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37 °C, 5 % CO2.

- Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của đại thực bào RAW 264.7 [34], [37].

Tế bào RAW 264.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tế bào/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37 °C và 5 % CO2 trong 24 giờ. Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h. Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau (tùy theo mẫu nghiên cứu) trong 2 giờ trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24 giờ.

Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là L-NMMA ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0,8 μg/ml.

Nitrit (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System. Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 μL thuốc thử Griess: 50 μL dung dịch sulfanilamid 1 % (khối lượng/thể tích) trong acid phosphoric 5 %; và 50 μL dung dịch N-1- naphthylethylendiamin dihydroclorid 0,1 % (khối lượng/thể tích) pha trong nước. Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrit sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm. Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blank).

Dựng đường chuẩn NaNO2 với dải nồng độ thích hợp.

Hàm lượng nitrit của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong

hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS). Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức :

% ức chế = 100 - [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS]*100 (%)

Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50 % sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

- Phép thử sinh học xác định khả năng gây độc tế bào bằng MTT (làm song song với thử nghiệm ức chế sản sinh NO)

Chất thử (20 L) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ tương tự nồng độ của thí nghiệm NO. Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút 180 L tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO10 %.

Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37 oC, 5% CO2, nuôi trong thời gian 24 giờ (chạy song song với thí nghiệm ức chế NO ở trên). Sau 24 giờ, 10 µL MTT (nồng độ cuối cùng là 5 mg/mL) được cho vào mỗi giếng. Sau 4 giờ, loại bỏ môi trường, tinh thể formazan được hòa tan bằng 50 µL (DMSO) 100 %.

Giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ.

Lượng tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:

% tế bào sống sót=(ODchất thử - ODđối chứng trắng)*100/(ODDMSO - ODđối chứng trắng) (%)

2.3.6.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Hoạt tính kháng tế bào ung thư được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

* Phương pháp xác định tác dụng gây độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa KǶ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990) [159] và Monks và cộng sự (1991) [111]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (Optical Density, OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử được pha thành các dải nồng độ thích hợp.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Chất thử đã pha ở các nồng độ được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL và 0,8 g/mL. Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng TCA 20 %.

- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 °C, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.

- Sử dụng unbuffered tris base 10 mM để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút. Đọc kết quả OD ở bước sóng 515–540 nm trên máy ELISA Plate Reader. Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua

công thức sau:

% ức chế = 100% - [(ODchất thử – ODngày 0) * 100 / (ODđối chứng âm – ODngày 0)] (%)

- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticin ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL được sử dụng như là chất đối chứng dương;

- DMSO10 % luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50 % sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

* Phép thử sinh học xác định tác dụng gây độc tế bào ung thư đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch (HL-60)

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa KǶ (National Cancer Institute, NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng gây độc tế bào ở điều kiện in vitro. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Mosmann (1983). Tác giả sử dụng muối tetrazoli (MTT) làm thuốc thử trong phép so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào. Vòng tetrazoli của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động. Dưới tác dụng của enzym dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành hợp chất formazan có màu tím [112]. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử (20 L) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 100

g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL.

- Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút 180 L tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10 %.

- Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37 °C, 5 % CO2, nuôi trong thời gian 72 giờ.

- Sau 72 giờ, 10 µL MTT (nồng độ cuối cùng là 5 mg/mL) được cho vào mỗi giếng.

- Sau 4 giờ, loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 50 µL (DMSO) 100 %.

- Giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ.

Lượng tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:

% sống sót =(ODchất thử - ODđối chứng trắng) *100/(ODDMSO - ODđối chứng trắng) (%)

% ức chế = 100% - % sống sót

- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticin luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10

g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL.

- DMSO 10 % luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50 % sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

2.3.7. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống viêm in vivo của dẫn chất tiềm

năng

* Vật liệu nghiên cứu

- Loài: Chuột nhắt trắng thuần chủng dòng BALB/c; Cân nặng: 21–24 g.

- Số lượng: 24 chuột con (12 chuột đực và 12 chuột cái)

- Nguồn gốc: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

- Điều kiện chăm sóc: chuột thí nghiệm được nuôi trong điều kiện chuồng thoáng

mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của chuột.

* Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm in vivo

Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm được tiến hành theo phương pháp của Pacheco và cộng sự (2014) [124], Giner và cộng sự (2000) [56], Recio và cộng sự (2000) [144].

Bố trí thí nghiệm: 24 chuột được bôi mẫu nghiên cứu liều 2 mg/20 µL/tai hoặc dung môi pha mẫu (mẫu pha trong DMSO và aceton theo tỷ lệ 1 : 1) vào 1 tai chuột.

- Lô 1 (đối chứng): bôi 20 µL/tai DMSO và aceton (tỷ lệ 1 : 1)

- Lô 2 (thử): Bôi dung dịch mẫu nghiên cứu liều 2 mg/20 µL/tai

- Lô 3: Bôi curcumin liều 2 mg/20 µL/tai

- Lô 4: Bôi dexamethason liều 0,1 mg/20 µL/tai

Sau đó bôi EPP liều 1 mg/20 µL/tai (EPP pha trong aceton). Đo độ dày của tai tại vị trí gây viêm, tại các thời điểm: 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút sau khi gây viêm bằng EPP bằng thước kẹp điện tử capliper Mitutoyo.

Xử lí số liệu: Các số liệu được xử lí trên Excel, được trình bày dạng Trung bình (TB) ± SE (standard error). Các thuật toán thống kê t-test để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng âm, với P < 0,05 được coi là sai khác có ý nghĩa thống kê.

2.3.8. Phương pháp đánh giá độc tính cấp của dẫn chất tiềm năng

Thử nghiệm được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo các TLTK [5], [17], [120], [121], [183].

* Vật liệu nghiên cứu

- Loài: Chuột nhắt trắng thuần chủng dòng BALB/c; Cân nặng: 18-22 gam.

- Số lượng: 70 con (35 chuột đực và 35 chuột cái).

- Nguồn gốc: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.

- Điều kiện chăm sóc: Chuột thí nghiệm được nuôi trong điều kiện chuồng thoáng

mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của chuột.

- Cân nặng: Tất cả chuột thí nghiệm trước khi tiến hành thí nghiệm được xác định cân nặng.

* Phương pháp nghiên cứu

Nguyên tắc: Cho chuột thử nghiệm uống cùng liều mẫu nghiên cứu trong điều kiện ổn định như nhau, quan sát các phản ứng xảy ra trong 72 giờ.

Thử nghiệm sơ bộ: Cho 10 chuột (50 % đực, 50 % cái) nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi cho uống mẫu nghiên cứu ở liều duy nhất, liều cao 10 g/kg thể trọng qua đường uống (thể tích tối đa là 0,2-0,3 mL/10 g trọng lượng chuột – theo ƠHướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệuƠ của Bộ y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015) [5]. Theo dõi và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu và số lượng chết của chuột trong vòng 72 giờ. Tùy theo số chuột chết ở thử nghiệm sơ bộ để phân loại và tiến hành thử nghiệm chính thức.

Thử nghiệm chính thức: Có 3 trường hợp có thể xảy ra: