Một Số Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Quá Trình Chiết

toàn Phương pháp chiết Soxhlet thuộc loại phương pháp chiết bán liên tục, nguyên liệu cho vào bộ Soxhlet và đứng yên trong khi dung môi chuyển động liên tục Phương pháp chiết Soxhlet có ưu điểm: Chiết kiệt, tiết kiệm được dung môi thu hồi dung môi). Tuy nhiên, có những nhược điểm: Lượng nguyên liệu chiết phụ thuộc nhiều vào thể tích thiết bị, tiến hành phức tạp, thiết bị đắt tiền [19].

Ngoài ra, phương pháp chiết còn được phân loại dựa vào các yếu tố sau:

- Dựa vào chế độ làm việc có các phương pháp chiết sau: Gián đoạn, bán liên tục, liên tục

- Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương pháp: Ngược dòng, xuôi dòng, chéo dòng.

- Dựa vào áp suất làm việc, có các phương pháp chiết ở: Áp suất thường, áp suất giảm áp suất chân không , áp suất cao làm việc có áp lực

- Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha, có các phương pháp chiết sau: Ngâm, ngấm kiệt

Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp siêu âm, phương pháp tạo dòng xoáy, phương pháp mạch nhịp... [19].

Trong đề tài nghiên cứu này, sử dụng phương pháp chiết Soxhlet và chưng ninh trong quá trình chiết mẫu thực vật phục vụ việc phân lập, định danh, xác định thành phần, cấu trúc hóa học. Lựa chọn phương pháp chưng ninh hồi lưu để xây dựng quy trình chiết tạo ra cao chiết bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm.

1.2.1.1. Phương pháp chưng ninh hồi lưu

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 151 trang tài liệu này.

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương pháp chưng ninh hồi lưu, cây mật nhân cũng từng là đối tượng được nghiên cứu trước đó Phương pháp chưng ninh hồi lưu được định hướng từ các nghiên cứu của nhóm tác giả Anisa Rahmalia và cộng sự vào năm 2011, nhóm tác giả Zakia Khanam và cộng sự vào năm 2015 [20] [21].

1.2.1.2. Phương pháp chiết Soxhlet

Lựa chọn phương pháp Soxhlet được định hướng từ các nghiên cứu của nhóm Tee Thiam Tsui và cộng sự vào năm 2005, nhóm nghiên cứu Đào H ng Cường và cộng sự năm 2010 và nhóm nghiên cứu Nursyazura Khari và cộng sự vào năm 2014 [22] [23] [24].

1.2.1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

a. Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của nguyên liệu

- Màng tế bào dược liệu

- Chất nguyên sinh

- Một số tạp chất có thể có trong nguyên liệu

Những yếu tố này thì không thể thay đổi được trong quá trình sản xuất, mà phụ thuộc vào nguyên liệu sử dụng, do vậy, trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi không nghiên cứu sâu về nội dung này [8].

b. Những yếu tố thuộc về dung môi

- Độ phân cực của dung môi: Dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực [8].

- Theo tác giả Rajeev Bhat và cộng sự, trong thành phần rễ cây mật nhân thành phần chủ yếu là các quassinoid và alkaloid, trong đó, các alkaloid là những hợp chất có tính chất phân cực mạnh, còn các quassioid là những dẫn xuất của triterpen, là những hợp chất phân cực vừa. Do đó, những thành phần này có thể hòa tan tốt trong các dung môi phân cực như nước Mặt khác, nước là một dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, an toàn khi bổ sung vào thực phẩm, lại không gây m i vị khó chịu đối với thực phẩm Ngoài ra, dung môi ethanol 80 % trong nước được xem là dung môi vạn năng, có thể hòa tan hầu hết các hợp chất từ phân cực mạnh đến ít phân cực, ethanol cũng có thể sử dụng trong thực phẩm Vì vậy, lựa chọn nước và ethanol 80 % trong nước làm dung môi trong nghiên cứu sau này [25].

- Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi: Dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất và ngược lại [8].

c. Những yếu tố về kỹ thuật

Yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Đó có thể là những yếu tố như nhiệt độ, thời gian, độ mịn của dược liệu, khuấy trộn, siêu âm... [8].

- Sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha: Trong quá trình trích ly, sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha là động học của quá trình trích ly, do đó sự chênh nồng độ giữa hai pha càng lớn thì quá trình trích ly diễn ra càng nhanh và thuận lợi Chính vì thế,

trong quá trình trích ly người ta luôn tìm mọi cách để tăng sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha: Trích ly ngược chiều, tuần hoàn dung môi, bổ sung dung môi trong quá trình trích ly, thay mới dung môi cuối quá trình trích ly [8].

- Nhiệt độ chiết: Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó, theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm nên tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây ra bất lợi cho những hợp chất k m bền ở nhiệt độ cao, gây phá hủy một số hoạt chất như vitamin, glycosid, alkaloid, Một số bất lợi khác có thể kể đến như khi nhiệt độ tăng làm tăng độ hòa tan của tạp chất, dung môi dễ bị hao hụt và đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt, độ hòa tan của chúng giảm khi nhiệt độ tăng Vì vậy, tùy trường hợp cụ thể, chúng ta cần lựa chọn nhiệt độ sao cho ph hợp [8].

- Thời gian chiết: Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn Do đó nếu thời gian chiết quá ngắn sẽ không chiết được hết các hoạt chất trong dược liệu Nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp chất, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Nhưng đến một giới hạn nào đó thì quá trình chiết sẽ đến trạng thái cân bằng d có k o dài thời gian thì quá trình trích ly cũng không tiếp tục diễn ra Vì vậy, cần thiết phải lựa chọn thời gian chiết sao cho ph hợp với thành phần dược liệu, dung môi và phương pháp chiết [8].

Ngoài những yếu tố kể trên, còn nhiều yếu tố khác cũng gây ảnh hưởng đến quá trình chiết như độ mịn, khuấy trộn, áp suất, pH môi trường, chấn động cơ học, dòng điện cao áp.... [8].

Những yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, thay đổi các yếu tố này trong quá trình sản xuất là dễ dàng thực hiện. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn ba yếu tố của quá trình chiết xuất là tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu, nhiệt độ chiết và thời gian chiết để tiến hành quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng bằng quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu [26].

1.2.2. Tổng quan về phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học

Sau quá trình chiết từ các dung môi khác nhau, dịch chiết được cô khô tạo thành

cao chiết, tách và tinh chế các hợp chất có trong cao chiết bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi thích hợp.

Sắc ký cột (CC): Nhằm phân lập các đơn chất từ hỗn hợp. Nguyên tắc: Sắc ký hấp phụ có thể được tiến hành trên một cột thủy tinh th ng đứng với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ dưới tác động của trọng lực Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra lần lượt trước hoặc sau. Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh sử dụng silicagel Đối với các chất phân cực có thể sử dụng sephadex LH-20 hoặc ngược pha RP-18 Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc d ng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế [19].

Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC): Nhằm xác định hệ dung môi để chạy sắc ký cột, kiểm tra thành phần độ tinh khiết của các hỗn hợp, các phân đoạn của sắc ký cột. Nguyên lý: Sắc ký bản mỏng TLC là sắc ký hấp phụ được tiến hành trên một bản mỏng, chất hấp phụ là silicagel hay oxýt nhôm. Sau khi nhúng bản mỏng vào dung dịch chiết, lấy ra sấy nhẹ, sẽ phát hiện các vết. Sắc ký bản mỏng được sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp [19].

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương pháp vật lý (tonc, []Dvà các phương pháp phân tích hóa lý:

- Sắc k lỏng khối phổ LC-MS, LC-MS/MS : Sử dụng cho các đối tượng là

những hợp chất có khối lượng phân tử lớn, khó bay hơi

- Hồng ngoại IR : Sử dụng định danh các nhóm chức có trong hợp chất

- Phổ khối va chạm electron EI-MS);

- Phổ khối ion hóa bằng bụi electron ESI-MS);

- Phổ khối có độ phân giải cao HR-ESI-MS);

- Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và hai chiều HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) [27] [28].

1.2.3. Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

1.2.3.1. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào ung thư

Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư

Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phương pháp thử nghiệm xác định tính độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp và đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch [29] [30].

a. Xác định khả năng gây độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp

Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp là phương pháp dạng SRB. Phương pháp này được thực hiện tương tự theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [29].

b. Xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch

Phương pháp xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch là phương pháp dạng MTT. Phương pháp này được thực hiện tương tự theo phương pháp của Mosmann Bernardes và cộng sự vào năm 1983 Nhóm tác giả sử dụng muối tetrazolium MTT-(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong ph p so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào Vòng tetrazolium của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Như vậy, càng nhiều formazan thì tỷ lệ tế bào sống sót càng cao [30].

1.2.3.2. Xác định khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO

Việc sản xuất NO sinh lý là cực kỳ quan trọng để bảo vệ cơ thể, tuy nhiên, sản xuất quá mức và các chất chuyển hóa của nó có liên quan đến sự phát triển của các bệnh lý, ch ng hạn như sốc nhiễm trùng do vi khuẩn và viêm mãn tính. Phương pháp khảo sát khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO là phương pháp được sử dung phổ biến trong việc thăm dò hoạt tính kháng viêm đối với các loại thực vật nhằm đánh giá tác nhân ngăn chặn sản xuất có thể có lợi cho việc điều trị phản ứng viêm. Ngoài

ra, các loài gốc tự do cũng chịu trách nhiệm kích hoạt một số yếu tố phiên mã tiền viêm, có liên quan đến việc thúc đẩy các bệnh viêm [31].

Đến thời điểm nghiên cứu, chưa có công bố nào về khả năng kháng viêm trên đối tượng dịch chiết rễ cây mật nhân, do đó, trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, khảo sát khả năng này nhằm tìm ra đặc tính mới, bổ sung giá trị cho nguyên liệu đã lựa chọn nghiên cứu.

1.2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase

Chứng tăng đường huyết sau khi ăn dẫn đến sự tiến triển của bệnh tiểu đường tu p 2, do đó phương pháp ức chế hoạt động của enzyme -glucosidase trong điều trị tiểu đường tu p 2 là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay.

Khảo sát khả năng ức chế enzyme α- glucosidase qua đó đánh giá được khả năng kháng bệnh đái tháo đường tuýp 2 của dịch chiết nước. Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-nitrophenyl--D-glucopyranoside nhờ tác động của enzyme  - glucosidase, qua đó giải phóng sản phẩm là p-nitrophenol có màu vàng Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra, qua đó phản ánh hoạt độ của enzyme  - glucosidase [32].

1.2.3.4. Xác định hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm

Viêm là một cơ chế bảo vệ do các yếu tố hóa học khác nhau gây ra, và bao gồm các thay đổi phức tạp, tuần tự để loại bỏ nguyên nhân ban đầu, nhiều bệnh được theo sau bởi các quá trình viêm cấp tính hoặc mãn tính với sản xuất nhiều chất trung gian hóa học, ch ng hạn như xơ vữa động mạch, bệnh Alzheimer, ung thư, hen suyễn và các bệnh nhiễm tr ng, như bệnh lao [31].

Cytokine là các protein hay glycoprotein không phải kháng thể được sản xuất và phóng thích bởi các tế bào bạch cầu viêm và một số tế bào khác không phải bạch cầu. Các protein này hoạt động trong vai trò là các chất trung gian điều hòa giữa các tế bào trong cơ thể, các nghiên cứu và hiểu biết về vai trò sinh l cũng như sinh l bệnh của cytokine đã đạt được những thành tựu đáng kể. Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm. Tuy nhiên các phân tử này cũng đóng vai trò khá quan trọng trong các bệnh l như: Bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư.

Cytokine tham gia vào nhiều quá trình sinh lý bao gồm điều chỉnh các phản ứng miễn dịch và viêm. Các phân tử hiệu ứng này được tạo ra tạm thời và cục bộ kiểm soát biên độ và thời gian của phản ứng Phương pháp xác định hàm lượng cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm giúp đánh giá khả năng kháng viêm của tế bào vì nếu quá trình sản xuất quá nhiều hoặc không đủ cytokine có thể góp phần đáng kể vào sinh lý bệnh của một loạt bệnh tự miễn dịch, các bệnh truyền nhiễm và đào thải khi ghép tạng (ví dụ, IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-alpha) [33].

1.2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng tương tự phương pháp nghiên cứu của Hadacek và cộng sự vào năm 2000 [34].

Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC Minimum inhibitor concentration - nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50 % inhibitor concentration - nồng độ ức chế 50% , MBC Minimum bactericidal concentration - nồng độ tối thiểu diệt khuẩn Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người như:

- Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram + , sinh bào tử, thường không gây bệnh

- Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram + , gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm tr ng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

- Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram + , vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật

- Escherichia coli là vi khuẩn Gram (- , gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm l trực khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram (- , trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm tr ng huyết, các nhiễm tr ng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Salmonella enterica là vi khuẩn Gram - , vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm tr ng đường ruột ở người và động vật

- Candida albicans là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.

Môi trường nuôi cấy: MHB Mueller- Hinton Broth), MHA (Mueller - Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud – 2 % dextrose broth) và SA (Sabouraud – 4 % dextrose agar cho nấm.

Chất tham khảo:

- Kháng sinh ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram +

- Kháng sinh cefotaxim cho các chủng vi khuẩn Gram -)

- Kháng nấm nystatin cho chủng nấm

Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN:

IC(%)  100x

ODtest ODcontrol() ODcontrol() ODcontrol()

Giá trị MBC2đ.ược xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch

1.2.3.6. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa

Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa thường được sử dụng như sau:

a. Phương pháp thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do. Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm – 517 nm [35]. Phương pháp này thực hiện nhanh chóng, đơn giản, chính xác và có thể đo hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất khác nhau.

b. Phương pháp dựa vào năng lượng khử

Năng lực khử được xác định tương tự theo các phương pháp được sử dụng của nhóm nghiên cứu Oyaizu và cộng sự năm 1986, nhóm nghiên cứu Nguyễn Xuân Duy và cộng sự năm 2013. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp khử kali ferricyanide để xác định quá trình khử, phản ứng chuyển hóa Fe3+ thành Fe2+. Nhiều thể tích khác nhau của dịch chiết được trộn với đệm phosphate pH = 6,6 để đạt thể tích cuối c ng 1,5 mL trước khi thêm 0,5 mL K3(Fe[CN31 % Hỗn hợp được ủ ở 50 oC trong 20 phút, sau