Phân đoạn F8 và F9 được gộp lại ký hiệu F8 (1,7 g được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043 mm - 0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 98:2 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 19 phân đoạn, được ký hiệu là F8 1 đến F8 19 Phân đoạn F8 12 200 mg được tách qua sắc ký cột sephadex rửa giải bằng MeOH thu được 7 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F8.12.1 đến F8 12 7 Phân đoạn F8.12.3 sau hai lần được tách bằng sắc ký cột sephadex thu được 10 mg chất sạch rắn, màu trắng k hiệu là EL1B (chất 1) và 5 mg chất rắn màu trắng EL1C (chất 4).
Phân đoạn F3 và F7 được gộp lại ký hiệu F3 17 g và được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 9:1 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1 và cuối cùng rửa giải cột bằng hệ dung môi MeOH:H2O 1:1 , thu được 15 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F3.1 đến F3. 15.
Phân đoạn F3.2 (1.2 g được tách bằng sắc ký cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 95:5 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 14 phân đoạn ký hiệu từ F 3 2 1 đến F3.2.14.
Phân đoạn F3.2.12 (20 mg) sau hai lần qua cột Sephadex thu được 6 mg chất sạch dạng rắn màu vàng ký hiệu EL4 (chất 2). Phân đoạn F3.6 (0,12 g) tách bằng sắc ký cột silicagel hệ dung môi DCM:MeOH 95:5 thu được 4 phân đoạn Phân đoạn F3.6.2 được tách bằng sắc k thu được 4 mg chất sạch màu trắng ký hiệu EL5 (chất 3).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết nước của rễ cây mật nhân được mô tả ở hình 2.3 và hình 2.4 [5].
b. Nhóm hợp chất khác
Rễ mật nhân
n- hexane
Chiết Soxhlet trong 24 giờ
Bả
Lọc
Ngâm chiết với ethanol
85 % trong 3 giờ
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0C, số vòng quay: 40
Chiết trong ethyl acetate
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0C, số vòng quay: 40
Cao chiết ethyl acetate
Cao chiết n-hexane
Hình 2.5. Sơ đồ tạo cao chiết n-henxane và cao chiết ethyl acetate
Cao chiết n-hexane (4,1 g)
PĐH 1…PĐH 10
chọn PĐH6
MNH1 (6 mg)
(vàng)
Cao chiết ethyl acetate (35 g)
PĐE 25
PĐE 34 550 mg
SKC, dung môi rửa giải là MeOH/H2O 1/1 thu được 5 phân đoạn PĐE 34 1- PĐE 34 5
PĐE 34 1 PĐE 34 5
chọn PĐE 34 2 1,2 g
MN.34.2 (6 mg) (trắng)
SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn PĐH1- PĐH10
MN.25.10 (20 mg)
(trắng)
SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn PĐE 1- PĐE 92
Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các chất không thuộc nhóm alkaloid
Tiến hành chiết Soxhlet trong n-hexane 3 kg bột rễ cây mật nhân trong 7 lít dung môi trong 24 giờ, dịch chiết được lọc, gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 4,1 g cặn. Phần bã được ngâm chiết với ethanol 85 % 3 kg bã được chiết trong 8 lít dung môi trong 3 giờ), khuấy ở nhiệt độ 50 oC và tiếp tục để ngâm qua đêm Sau ba lần chiết, dịch chiết được lọc và quay cất dưới áp suất giảm đến thể tích khoảng 500 mL. Cho ethyl acetate vào, chiết phân lớp ba lần (mỗi lần 250 mL). Dịch chiết ethyl acetate được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 69,1 g cặn chiết ethyl acetate.
Cao chiết n-hexane 4,1 g được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH (9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn. Ở phân đoạn 6 thu được 6 mg một chất sạch màu vàng hình kim kết tinh được ký hiệu là MNH1 (chất 5).
Cao chiết ethyl acetate 35 g được phân tách bằng cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn ký hiệu từ PĐE 1 đến PĐE 92 Phân đoạn PĐE 25 có 20 mg chất sạch dạng bột màu trắng kết
tinh được đặt tên là MN.25.10 (chất 6 Phân đoạn PĐE 34 550 mg được chạy cột Rp với hệ dung môi rửa giải là MeOH:H2O (1:1) thu được 5 phân đoạn ký hiệu từ PĐE 34 1 đến PĐE 34 5 Phân đoạn PĐE 34 2 có 25 mg chất sạch dạng bột màu trắng kết tinh được đặt tên là MN.34.2 (chất 7).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết n-hexane và cao chiết ethyl acetate của rễ cây mật nhân được mô tả ở hình 2.5 và hình 2.6 [7].
2.4.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được
Cấu trúc hóa học của các chất sạch được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương pháp vật lý (tonc, []Dvà các phương pháp phổ hiện đại như: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ khối ion hóa bằng bụi electron (ESI- MS), phổ khối có độ phân giải cao (HR-ESI-MS , phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) [27] [28].
2.4.3. Phương pháp xây dựng quy trình chiết rễ mật nhân
Rễ cây mật nhân được ứng dụng để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm dưới dạng cao chiết hoặc bột được chiết xuất từ nước và cồn thực phẩm. Vì vậy, dung môi được chúng tôi lựa chọn để thu nhận sản phẩm cao chiết từ rễ mật nhân là nước và ethanol 80 % Phương pháp chiết được chọn là phương pháp chưng ninh hồi lưu với nhiều lợi thế và hiệu quả như đã trình bày trong phần tổng quan.
- Mô hình tiến hành thí nghiệm:
Hình 2.7. Hệ thống chưng ninh hồi lưu
Hệ thống chưng ninh hồi lưu: Bao gồm một bình cầu nối với ống sinh hàn và được đặt trên bể điều nhiệt. Ống sinh hàn với dòng nước lạnh chảy qua liên tục nên khi dung môi bay hơi lên sẽ bị ngưng tụ trở lại bình do tránh sự tổn thất của cấu tử bị cuốn
theo dung môi bay hơi dưới tác dụng nhiệt và tiết kiệm lượng dung môi.
Quy trình chiết tổng quát được trình bày trên hình 2 8
Rễ mật nhân
Dung môi
Chưng ninh hồi lưu
Khảo sát các yếu tố:
+ Nhiệt độ chiết
+ Thời gian chiết
+ Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Bã
Lọc
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt
độ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút
Đo đại lượng đầu ra đối với dịch chiết: Hàm lượng EL4,
đối với dịch chiết ethanol 80 %: Hiệu suất chiết
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình chiết
Bột rễ mật nhân được chưng ninh ở điều kiện nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu xác định, sau đó, tiến hành lọc chân không thu được dich chiết Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút). Phân tích đại lượng đầu ra đối với dịch chiết nước: Hàm lượng EL4 cao nhất, đối với dịch chiết ethanol 80 %: Hiệu suất chiết từ khối lượng cao khô trước và sau quá trình chiết
Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình chiết rễ mật nhân được trình bày tại phụ lục 2
2.4.3.1. Chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 80 %
Quy trình chiết rễ mật nhân trong dung môi ethanol 80 % dựa trên việc tham khảo và kế thừa các kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả C K Foong và cộng sự vào năm 2015, nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh, Mai Hưng Trấn vào năm 2017 [74] [84]. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết được tối ưu bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 3 yếu tố 2 mức, các mức yếu tố được lựa chọn lần lượt:
- X1: Nhiệt độ chiết 60 oC đến 80 oC;
- X2: Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20/1 mL/g đến 40/1 mL/g;
- X3: Thời gian chiết 2 giờ đến 4 giờ;
- Hàm mục tiêu Y: Hiệu suất chiết cao nhất, trong đó, hiệu suất chiết được xác định bằng phương pháp cô quay chân không dung dịch lọc sau chưng ninh hồi lưu, sấy đến khối lượng cặn không đổi Hiệu suất chiết H, % là tỷ lệ phần trăm giữa khối lượng cao khô mật nhân thu được sau khi sấy khô m2, g với khối lượng mẫu thí nghiệm ban đầu (m1, g).
Các bước thực hiện quy hoạch thực nghiệm [85]:
Bước 1: Xác định một điểm xuất phát nằm trong miền giới hạn tổng thể của các biến đầu vào. Chọn điểm đó làm mức cơ bản. Chọn khoảng biến thiên của từng biến để xác định miền giới hạn của quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1.
Bước 2: Thực hiên các thí nghiệm theo quy hoạch trực giao cấp 1. Xây dựng phương trình hồi quy bậc nhất: Nếu phương trình hồi quy bậc nhất không tương thích thì chuyển đến thực hiện bước 4. Nếu phương trình hồi quy bậc nhất tương thích thì thực hiện bước 3.
Bước 3: Xác định vectơ gradient của hàm mục tiêu tại mức cơ bản và xuất phát từ mức cơ bản xác định tọa độ các điểm thực nghiệm nằm cách đều nhau trên hướng của vectơ gradient với khoảng cách tự chọn phù hợp với đối tượng nghiên cứu. Làm thực nghiệm để xác định một điểm có giá trị hàm mục tiêu tốt nhất trên hướng gradient. Chọn điểm tìm được làm điểm xuất phát mới và quay về bước 2.
Bước 4: Thực hiên các thí nghiệm theo quy hoạch cấp 2 trực giao hoặc là tâm quay.
Bước 5: Xây dựng phương trình hồi quy bậc hai:
Nếu phương trình hồi quy bậc 2 không tương thích thì chuyển tới thực hiện bước 6.
Nếu phương trình hồi quy bậc hai tương thích thì thực hiện bước 7.
Bước 6: Thu hẹp khoảng biến thiên của các biến đầu vào rồi quay về bước 5.
Bước 7: Tìm cực trị của hàm mục tiêu thu được ở dạng phương trình hồi quy bậc 2 thu được ở bước 5 và thực nghiệm lại để kiểm chứng và đánh giá kết quả.
Phương trình biểu diễn mối quan hệ có dạng: Y = f(X1, X2, X3)
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm trên, lập các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm
Các yếu tố ảnh hưởng | |||
Nhiệt độ X1 (oC) | Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu X2 (mL/g) | Thời gian X3 (giờ) | |
Mức dưới | 60 | 20/1 | 2 |
Mức cơ sở | 70 | 30/1 | 3 |
Mức trên | 80 | 40/1 | 4 |
Khoảng biến thiên | 10 | 10/1 | 1 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Phương Pháp Xác Định Khả Năng Không Gây Độc Đối Với Tế Bào Người -
Danh Mục Các Hợp Chất Được Phân Lập Từ Cây Mật Nhân -
Phương Pháp Phân Lập, Xác Định Cấu Trúc Hóa Học Của Các Hợp Chất Từ Rễ Cây Mật Nhân -
Bố Trí Thí Nghiệm Khảo Sát Yếu Tố Thời Gian Chiết -
Khảo Sát Một Số Thành Phần Cơ Bản Của Nguyên Liệu -
Kết Quả Phân Lập, Định Danh Các Hợp Chất Không Thuộc Nhóm Alkaloid
Xem toàn bộ 151 trang tài liệu này.
Chọn phương án quy hoạch trực giao cấp 1 (TYT2k) thực nghiệm yếu tố toàn phần 2 mức, k = 3 yếu tố ảnh hưởng Phương trình hồi quy có dạng:
Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3+ b12x1x2 + b23x2x3+ b13x1x3+b123x1x2x3 (2.1) [85] Trong đó: - x1: Nhiệt độ chiết (oC);
- x2: Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g).
- x3: Thời gian chiết (giờ);
Với 3 yếu tố tối ưu k = 3 , số thí nghiệm phải thực hiện là N = 2k = 23 = 8 [85] thí nghiệm của quy hoạch trực giao cấp 1 và 3 thí nghiệm tại tâm phương án Tổ chức thí nghiệm và thu được kết quả thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Ma trận và kết quả thí nghiệm
Yếu tố thí nghiệm trong hệ tọa độ không thứ nguyên | Yếu tố thí nghiệm | Y (%) | ||||||
x0 | x1 | x2 | x3 | X1 (oC) | X2 (mL/g) | X3 (giờ) | ||
1 | + | + | + | + | 80 | 40/1 | 4 | 6,916 |
2 | + | - | + | + | 60 | 40/1 | 4 | 5,566 |
3 | + | + | - | + | 80 | 20/1 | 4 | 6,888 |
4 | + | - | - | + | 60 | 20/1 | 4 | 5,702 |
5 | + | + | + | - | 80 | 40/1 | 2 | 6,368 |
6 | + | - | + | - | 60 | 40/1 | 2 | 5,602 |
7 | + | + | - | - | 80 | 20/1 | 2 | 6,466 |
8 | + | - | - | - | 60 | 20/1 | 2 | 5,442 |
T1 | + | 0 | 0 | 0 | 70 | 30/1 | 3 | 6,476 |
T2 | + | 0 | 0 | 0 | 70 | 30/1 | 3 | 6,476 |
T3 | + | 0 | 0 | 0 | 70 | 30/1 | 3 | 6,610 |
Trong đó:
+ T1, T2, T3 là thí nghiệm tại tâm phương án;
+ X1, X2, X3 là các thông số tối ưu;
+ x1, x2, x3 là các biến mã không thứ nguyên tương ứng với X1, X2, X3
2.4.3.2. Chiết rễ mật nhân trong dung môi nước
a. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bao gồm: Nhiệt độ chiết, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu. Các số liệu chọn để bố trí các thí nghiệm được kế thừa từ các kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả C K Foong và cộng sự vào năm 2015, nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh, Mai Hưng Trấn vào năm 2017 [74] [84].
Cách bố trí thí nghiệm được tình bày cụ thể sau:
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết rễ mật nhân Thí nghiệm được thực hiện với các thông số được trình bày ở bảng 2 3.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố nhiệt độ
1 | 2 | 3 | 4 | |
Nhiệt độ chiết (oC) | 70 | 80 | 90 | 100 |
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g) | 20/1 | |||
Thời gian chiết (phút) | 120 | |||
Hàm lượng EL4 (mg/kg) | Y1 | Y2 | Y3 | Y4 |
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến quá trình chiết mật nhân Thí nghiệm được thực hiện với các thông số được trình bày ở bảng 2 4.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
5 | 6 | 7 | 8 | |
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g) | 10/1 | 20/1 | 30/1 | 40/1 |
Thời gian chiết (phút) | 120 | |||
Nhiệt độ chiết (oC) | Đã khảo sát tại thí nghiệm 1 | |||
Hàm lượng EL4 (mg/kg) | Y5 | Y6 | Y7 | Y8 |
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình chiết mật nhân Thí nghiệm được thực hiện với các thông số được trình bày ở bảng 2 5.