Bố Trí Thí Nghiệm Khảo Sát Yếu Tố Thời Gian Chiết

Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố thời gian chiết

Số thứ tự mẫu

9	10	11	12
Thời gian chiết (phút)	60	90	120	150
Nhiệt độ chiết (oC)	Đã khảo sát tại thí nghiệm 1
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (mL/g)	Đã tối khảo sát thí nghiệm 2
Hàm lượng EL4 (mg/kg)	Y9	Y10	Y11	Y12

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 151 trang tài liệu này.

Hàm mục tiêu Y: Hàm lượng chất EL4 cao nhất Định lượng chất EL4 có trong mẫu bằng hệ thống HPLC dựa trên nguyên tắc: Xác định diện tích pic trên sắc k đồ tại thời điểm mà thời gian lưu của mẫu trùng với thời gian lưu của chất chuẩn EL4. Sau đó từ đường chuẩn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic suy ra hàm lượng chất EL4 [23].

Điều kiện sắc ký:

- Pha động: MeOH : H2O = 70 % : 30 %

- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút

- Thể tích mẫu tiêm: 5 µL

- Detector Diode Array DAD, bước sóng: 254 nm

- Cột C8-250 mm, Post column system.

b. Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng

Trên cơ sở kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố, chúng tôi thực hiện tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước.

Chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1, 2 mức với 2 yếu tố ảnh hưởng Phương trình hồi quy có dạng:

Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 (2.2) [85].

Trong đó: - x1: thời gian chiết (giờ);

- x2: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g). Hàm mục tiêu: Hàm lượng EL4 (mg/kg) lớn nhất.

Với 2 yếu tố tối ưu k = 2 , số thí nghiệm phải thực hiện là N = 2k = 22 = 4 thí nghiệm của quy hoạch trực giao cấp 1 và 3 thí nghiệm tại tâm phương án

Ma trận thí nghiệm và kết quả thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực

nghiệm trực giao cấp 1 - yếu tố toàn phần với 2 yếu tố ảnh hưởng TYT22, được trình bày ở bảng 2.6.

Bảng 2.6. Ma trận và kết quả thí nghiệm

Thí nghiệm

Yếu tố thí nghiệm trong hệ tọa độ không thứ nguyên			Yếu tố thí nghiệm		Y (mg/kg)
x0	x1	x2	X1 (giờ)	X2 (mL/g)	Y (mg/kg)
1	+	+	+	3	40/1	14,4
2	+	-	+	1	40/1	13,2
3	+	+	-	3	20/1	14,1
4	+	-	-	1	20/1	13,1
T1	+	0	0	2	30/1	13,9
T2	+	0	0	2	30/1	13,9
T3	+	0	0	2	30/1	13,5

Trong đó:

- T1, T2, T3 là thí nghiệm tại tâm phương án

- X1, X2 là các thông số tối ưu

- x1, x2 là các biến mã không thứ nguyên tương ứng với X1, X2

- Y: Hàm mục tiêu, hàm lượng EL4 mg/kg

2.4.4. Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân

Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học trên đối tượng dịch chiết rễ cây mật nhân từ các dung môi chiết là nước và ethanol 80 % được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng, Trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm, mỹ phẩm – Sở Y tế tỉnh Thừa Thiên Huế, Trường đại học bách khoa – Đại học Đà Nẵng và Viện sinh học

– Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Các phương pháp cụ thể sau:

- Khả năng gây độc tế bào ung thư cytotoxic assay trên các dòng tế bào ung thư MKN7 dạ dày , SW626 buồng trứng , SK-Mel-2 da , NIH/3T3 nguyên bào sợi của gốc phôi chuột KB biểu mô , Hep-G2 (gan), LU-1 vú , MCF7 phổi được xác định dựa theo phương pháp đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp Khả năng gây độc tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư HL-60 bạch cầu được xác định dựa theo phương pháp đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch [29] [30].

- Hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm được xác định dựa theo phương pháp nghiên cứu của Wansu Park và cộng sự năm 2012 [33].

- Khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO được xác định dựa theo phương pháp của Bernardes và cộng sự vào năm 2014 [31].

- Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase được xác định dựa theo phương pháp của Hakamata và cộng sự vào năm 2009 [86].

- Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định dựa theo phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng của Hadacek và cộng sự vào năm 2000 [34].

Các thí nghiệm trên được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Viện sinh học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

- Hoạt tính kháng oxy hóa được xác định dựa theo phương pháp thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết vì điều kiện thực hiện thuận lợi và gần đây có nhiều tác giả đã chọn phương pháp này [35]. Các thí nghiệm này được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Trường đại học bách khoa – Đại học Đà Nẵng

- Thử độc tính bất thường được thực hiện dựa theo phương pháp được trình bày trong dược điển Việt Nam tập IV. Các thí nghiệm này được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm, mỹ phẩm – Sở Y tế tỉnh Thừa Thiên Huế

- Khả năng không gây độc đối với tế bào người được xác định dựa theo phương pháp của Skekan và công sự vào năm 1990 [87]. Các thí nghiệm này được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Viện sinh học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Các phép thử hoạt tính sinh học được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác với r2 ≥ 0,99. Trình tự tiến hành các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân nêu trên được trình bày cụ thể tại phụ lục 3.

2.4.5. Nghiên cứu ứng dụng bổ sung mật nhân trong sản xuất một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe

2.4.5.1. Cơ sở bổ sung mật nhân vào sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Việc bổ sung mật nhân có thể dưới dạng cao chiết hoặc bột vào quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe phải đáp ứng mục tiêu: Vừa đảm bảo yêu cầu đối với hoạt chất được bổ sung để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, vừa phải đáp ứng chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm và thị hiếu người dùng, cụ thể như sau:

- Căn cứ pháp l : Đối với thành phần tạo nên công dụng của sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, trong nội dung được quy định tại điều 10, Thông tư 43/2014/TT- BYT đã yêu cầu như sau: “Thành phần chính tạo nên công dụng của sản phẩm phải được liệt kê trước c ng tên đầy đủ và hàm lượng Các thành phần khác được liệt kê tiếp sau theo thứ tự giảm dần về khối lượng” Điều này cho thấy, văn bản không quy định bắt buộc hàm lượng bổ sung phải là bao nhiêu, tuy nhiên, cá nhân, tổ chức cần phải đảm bảo về khuyến cáo đối với sức khỏe người d ng nếu có [51].

- Căn cứ khoa học: Tham khảo một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có thành phần mật nhân được bán trên thị trường, cụ thể: Trong hướng dẫn sử dụng sâm Alipas thì một ngày có thể sử dụng từ 1 đến 2 viên sâm Alipas, mỗi viên chứa 240 mg tinh chất mật nhân QPA mật nhân chứa 400 mg mật nhân mỗi viên được khuyên d ng từ 1 đến 2 viên mỗi ngày Thông tin hướng dẫn sử dụng của Hadariki Tongkat Ali cũng cho biết rằng liều lượng sử dụng một ngày là từ 1 đến 2 viên sâm Alipas, mỗi viên chứa 500 mg tinh chất mật Như vậy, với kết quả các nghiên cứu trước đây đối với loại sản phẩm này, liều d ng cao chiết từ mật nhân cho ph p dao động từ 240 đến 1000 mg/ngày đối với một người bình thường Bên cạnh đó, dịch chiết mật nhân đã được thử nghiệm độc tính bất thường và khả năng gây độc tế bào người với kết quả đạt yêu cầu, do đó, việc bổ sung một lượng cao chiết mật nhân hoặc bột mật nhân với liều lượng không quá 1000 mg trong một đơn vị sản phẩm vào quy trình sản xuất thực phẩm sẽ không gây nguy hại cho sức khỏe con người [77] [80].

2.4.5.2. Nghiên cứu sản xuất cao chiết mật nhân

- Sản xuất cao chiết mật nhân từ dung môi nước để sử dụng trực tiếp như một loại cao dược liệu Các chỉ tiêu chất lượng của cao chiết được thử nghiệm để đối sánh với theo yêu cầu kỹ thuật trong dược điển Việt Nam hiện hành và các chỉ tiêu đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

- Sử dụng cao chiết để bổ sung vào quy trình sản xuất trà thảo mộc mật nhân

2.4.5.3. Nghiên cứu sản xuất bột mật nhân

- Sản xuất bột mật nhân từ dịch chiết ethanol 80 % để bổ sung vào quy trình sản xuất nước rau má mật nhân.

2.4.5.4. Nghiên cứu sản xuất trà thảo mộc mật nhân và nước rau má mật nhân

Nghiên cứu bổ sung mật nhân vào quy trình sản xuất trà thảo mộc mật nhân nước

rau má mật nhân. Hai sản phẩm này định hướng dưới dạng thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Quá trình nghiên cứu, sản xuất và công bố chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có bổ sung mật nhân phải tuân thủ quy định theo Thông tư 43/2014/TT- BYT quy định về quản lý thực phẩm chức năng và đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm theo quy định của Nghị định 15/2018/NĐ-CP, các bước cơ bản được thực hiện bao gồm:

a. Tham khảo một số quy trình sản xuất thực phẩm đã được nghiên cứu và công bố.

b. Nghiên cứu bổ sung cao chiết mật nhân/ bột mật nhân: Hàm lượng bổ sung được xác định dựa trên các nghiên cứu trước đây đã ứng dụng trong các sản phẩm có bổ sung chiết xuất rễ mật nhân được bán trên thị trường.

c. Thực nghiệm sản xuất sản xuất trà thảo mộc mật nhân và nước rau má mật nhân.

- Nguyên liệu sản xuất trà thảo mộc mật nhân: Nụ vối, cỏ ngọt, cam thảo, la hán quả, cao chiết mật nhân: Sử dụng cao chiết được trình bày ở mục 2 4 5 2 để bổ sung vào quy trình sản xuất

- Công thức thử nghiệm sản xuất 1 lít trà thảo mộc mật nhân: Nụ vối khô: 30 g; quả la hán khô: 6 g; cỏ ngọt khô: 8,5 g; cam thảo: 1 g; nước: 1400 mL; cao chiết mật nhân.

- Nguyên liệu sản xuất nước rau má mật nhân: Rau má, bột mật nhân: Sử dụng bột mật nhân được trình bày ở mục 2 4 5.3 để bổ sung vào quy trình sản xuất

- Khảo sát tỷ lệ bổ sung chất trợ lắng: Trong quá trình thực hành sản xuất, nhận thấy nước rau má mật nhân là một hệ huyền ph với pha liên tục là nước và các chất hòa tan, còn pha phân tán là các phân tử thịt rau, do đó, khi bảo quản nước rau má trong thời gian dài dễ dẫn đến hiện tượng nước rau má bị phân lớp Vì vậy, cần nghiên cứu bổ sung chất phụ gia để ổn định cấu trúc của sản phẩm trong quá trình sản xuất nước rau má mật nhân

- Công thức thử nghiệm sản xuất 1 lít nước rau má mật nhân: Rau má: 265 g; nước: 795 mL; đường: 8 % ứng với 80 g; bột mật nhân; chất trợ lắng; NaHCO3 dùng để chỉnh pH

d. Kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm

- Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng: AOAC 999 11

- Phương pháp xác định hàm lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí TCVN 4884-

1:2015), Colifoms (TCVN 6848:2007), Escherichia coli (TCVN 7924-2:2008 , tổng số bào tử nấm men và nấm mốc TCVN 8275-1:2010).

Các thí nghiệm này được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng.

e. Đánh giá cảm quan sản phẩm

Sử dụng phương pháp cho điểm thị hiếu để đánh giá mức độ chấp nhận của người tiêu d ng đối với sản phẩm dựa theo phương pháp đánh giá của Nguyễn Hoàng Dũng và các cộng sự biên dịch năm 2007 [88].

 Nguyên tắc: Người thử được mời nếm thử sản phẩm, sau đó sẽ cho biết mức độ ưa thích, hài lòng của mình đối với từng sản phẩm bằng thang điểm đã được định nghĩa trước thông qua các thuật ngữ mô tả mức độ hài lòng Trong nghiên cứu này sử dụng thang thị hiếu 9 điểm được sắp xếp theo cấp độ tăng dần như sau:

1 - cực kì thích 6 - tương đối thích

2 - rất không thích 7 - thích

3 - không thích 8 - rất thích

4 - tương đối không thích 9 - cực kì thích 5 - không thích cũng không gh t

 Tổ chức thí nghiệm

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm cảm quan của trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng

- Người thử: Sinh viên trường đại học bách khoa Đà Nẵng, là những người không qua huấn luyện

- Số lượng người thử: 60 người không lặp lại

 Chuẩn bị và trình bày thí nghiệm

- Chuẩn bị dụng cụ: Thìa, ch n, nước thanh vị, giấy, bút

- Thiết kế phiếu chuẩn bị thí nghiệm cảm quan, phiếu hướng dẫn và phiếu trả lời

 Cách tiến hành

- Mỗi người tham gia thử sẽ nhận được phiếu hướng dẫn và phiếu trả lời, lần lượt thử và cho biết kết quả đánh giá vào phiếu trả lời

Các thí nghiệm cảm quan được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trường đại học bách khoa – Đại học Đà Nẵng.

f. Xử lý số liệu

- Các số liệu thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết được xử l bằng các phần mềm Matlab R2016a và Excel

- Các số liệu thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học được xử l bằng các phần mềm TableCurve 2Dv4 và Excel.

- Các số liệu thí nghiệm cảm quan được xử l bằng các phần mềm Excel

g. Công bố chất lượng sản phẩm

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Định danh mẫu thực vật và lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu

3.1.1. Kết quả định danh mẫu thực vật

Cây mật nhân được thu nhận tại v ng đồi núi huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai và huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, mẫu thực vật được định danh tại Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam với kết quả:

- Tên khoa học: Eurycoma longifolia jack

- Họ: Simaroubaceae

- Tên Việt Nam: Bách bệnh, bá bịnh, lồng bẹt, mật nhân, tho nan Tày , mờ lụ (Kho).

- Phân bố: Ở Việt Nam, cây mật nhân mọc phổ biến tại các tỉnh Quảng Ninh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, TP Hồ Chí Minh, Kiên Giang. Trên thế giới, khá phổ biến ở Ấn Độ, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippine.

Kết quả chi tiết được trình bày tại phụ lục 4.

3.1.2. Đánh giá, lựa chọn vùng nguyên liệu nghiên cứu

Đối với một nghiên cứu về một loại thảo dược, lựa chọn nguồn nguyên liệu rất quan trọng, mục đích vừa đảm bảo khai thác đúng loại dược liệu cần nghiên cứu, vừa đảm bảo chất lượng, sản lượng ổn định và đủ cho quá trình nghiên cứu lâu dài Do đó, ngoài việc định danh mẫu thực vật, chúng tôi cần thực hiện một số thực nghiệm để xác định nguồn nguyên liệu phục vụ nghiên cứu.

Chúng tôi thu nhận một số mẫu rễ cây mật nhân tại hai địa điểm: Vùng núi huyện Ia Grai – Gia Lai và huyện Phước Sơn – Quảng Nam. Thực hiện phân tích một số thành phần hóa học trong rễ mật nhân và thăm dò một số hoạt tính sinh học trên các đối tượng dịch chiết từ nguyên liệu của vùng này. Từ kết quả phân tích thu được, kết hợp với quan sát thực tế, chúng tôi lựa chọn địa điểm thu hái nhằm đảm bảo nguồn nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu.

Theo quan sát thực tế của chúng tôi trong quá trình nghiên cứu nguyên liệu, tại khu vực miền Trung - Tây Nguyên, v ng núi tỉnh Gia Lai và Quảng Nam là những nơi có cây mật nhân mọc tự nhiên rất nhiều, đặc biệt là ở v ng đồi núi của một số huyện thuộc tỉnh Gia Lai, mật nhân rất phong phú và được khai thác, bày bán ngoài thị trường phổ biến hơn các địa phương khác