Phương Pháp Xác Định Khả Năng Không Gây Độc Đối Với Tế Bào Người

đó thêm 0,5 mL TCA 10 % và 2 mL nước cất, cuối c ng 0,4 mL AlCl3 0,1 % được thêm vào Độ hấp thu quang học được xác định tại bước sóng 700 nm Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh Tính toán giá trị IC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,50 [36] [37].

c. Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa trên mô hình dầu - nước

Hệ nhũ tương dầu - nước được chuẩn bị gồm: 10 % dầu Olive, 85 % nước và 0,5 % Tween 40 Hỗn hợp được đồng hóa ở tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút Lấy chính xác 2 mL dịch chiết được trộn đều với 10 mL hệ nhũ tương dầu – nước chứa trong ống nhựa 50 mL có nắp đậy, được đặt trong tủ ổn nhiệt ở 50 oC, quá trình oxy hoá chất b o được quan sát hàng ngày Hàm lượng hydroperoxide được xác định trên dịch chiết chất b o theo phương pháp của Bligh and Dyer vào năm 1959 Hàm lượng hydroperoxide được xác định theo phương pháp của Richards và Hultin vào

năm 2002 Kết quả tính toán hàm lượng hydroperoxide từ đường chuẩn Cumene hydroperoxide (HPO) nồng độ từ 0-120 nmol/mL [36] [38] [39].

Ngoài ra, có một số phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa khác [35]:

- Phương pháp TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity : Xác định hoạt tính kháng oxy hóa so với khả năng chống oxy hóa của Trolox

- Phương pháp ORAC oxygen radical absorbance capacity : Xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động

- Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential : Khả năng kháng oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do

- Phương pháp FRAP ferric reducing-antioxidant power : Lực kháng oxy hóa bằng phương pháp khử sắt

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 151 trang tài liệu này.

- Phương pháp Conjugated Diene: Khảo sát nối đôi liên hợp

Các phương pháp trên có tính đặc hiệu cao, tuy nhiên, phương pháp phức tạp, khó thực hiện, các hóa chất sử dụng đắt tiền, khó cung cấp, đồng thời phòng thí nghiệm không được trang bị đầy đủ các thiết bị phục vụ phân tích.

1.2.3.7. Phương pháp thử độc tính

Thử độc tính để biết được nguy cơ gây tác động xấu đến sức khỏe con người khi tiếp xúc, ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như các sinh vật nơi sử dụng các sản phẩm. Giúp thiết lập liều lượng trong thử nghiệm lâm sàng để cung cấp thông tin ban

đầu về mẫu thử nghiệm Các phương pháp được sử dụng phổ biến đối với nghiên cứu trên đối tượng thảo dược như sau:

- Thử độc tính bất thường: Độc tính bất thường hay còn gọi là độc tính cấp là biểu thị sự tác động xấu hay sự tử vong của sinh vật ngay sau khi tiếp xúc với chất độc Độc tính cấp xảy ra do tiếp xúc với đơn hoặc đa yếu tố trong một thời gian ngắn và tác động cấp tính là tác động xảy ra trong vòng một vài ngày hoặc thậm chí là một vài giờ đầu tiên sau khi tiếp xúc với chất độc, thông thường thời gian gây độc cấp tính phải ít hơn hai tuần Mặt khác, vì những tác động mãn tính chỉ xuất hiện sau khi tiếp xúc lặp lại với một chất độc, trong nhiều trường hợp cần phải tiếp xúc liên tục hàng tháng Trong khi đó, tác nhân gây độc tính cấp được hấp thụ nhanh chóng vào cơ thể và sản sinh ra ngay lập tức các hiệu ứng độc cho cơ thể, song cũng có trường hợp, tiếp xúc cấp tính bị suy giảm độc tính Thử độc tính bất thường là một phương pháp để xác định tiêu chuẩn của một dạng thuốc nào đó Đó là tiêu chuẩn về độ an toàn của thuốc Trong thử độc tính bất thường quy định rõ: Động vật thử là gì, tình trạng con vật, cân nặng động vật, số con, liều thử, đường d ng, thời gian theo dõi, không có biểu hiện bệnh l và phải không có con vật nào chết Mục đích: Cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của thuốc, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính và tác dụng cũng như phạm vi an toàn của thuốc nghiên cứu tiếp theo [40] [41].

- Thử độc tính bán trường diễn: Thử độc tính dài ngày chỉ được tiến hành sau khi đã có thông tin về độc tính cấp trên động vật và mẫu thử được dự định sử dụng hoặc tiếp xúc dài ngày trên người Thử độc tính dài ngày nhằm xác định khả năng dung nạp của động vật thí nghiệm khi d ng mẫu thử nhiều lần Thông tin cần xác định có những biểu hiện độc tính sau khi d ng dài ngày, bao gồm:

Mức liều không hoặc có gây thay đổi đáng kể tới chức năng, cơ quan hoặc một số biểu hiện sống có thể quan sát được trên động vật thí nghiệm;

Những độc tính có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục nếu có [40].

Quy trình thử độc tính bất thường được thực hiện theo hướng dẫn tại phụ lục 13.5

– Dược điển Việt Nam.

1.2.3.8. Phương pháp xác định khả năng không gây độc đối với tế bào người

Việc phát triển một loại thảo dược hay thực phẩm mới từ tưởng ban đầu đến khi

đưa ra thành phẩm là một quá trình phức tạp có thể mất 12 ÷ 15 năm và tốn kém. Ý tưởng cho một mục tiêu có thể đến từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm nghiên cứu học thuật và lâm sàng và từ lĩnh vực thương mại. Xây dựng cơ sở bằng chứng hỗ trợ trước khi chọn mục tiêu cho một chương trình khám phá có thể mất nhiều năm Khi đã chọn được mục tiêu, ngành công nghiệp dược phẩm và gần đây là một số trung tâm học thuật đã đưa ra một số quy trình ban đầu để xác định các phân tử có các đặc tính phù hợp để tạo ra các loại sản phẩm được chấp nhận Đánh giá này sẽ xác định mục tiêu ban đầu, thông qua phát triển thử nghiệm, sàng lọc thông lượng cao, tối ưu hóa và cuối cùng là lựa chọn để phát triển lâm sàng [42].

Phương pháp xác định khả năng không gây độc đối với tế bào người nhằm đánh giá khả năng không gây độc của sản phẩm lên tế bào người khi sử dụng sản phẩm, phương pháp thực hiện trên HEK-293 - tế bào thận gốc phôi ở người (human embryonic kidney cells).

1.2.4. Tổng quan về quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.2.4.1. Tổng quan về thực phẩm bảo vệ sức khỏe

a. Khái niệm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Căn cứ vào khoản 1, điều 3, Nghị định 15/2018/NĐ-CP quy định: “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Dietary Supplement) là những sản phẩm được d ng để bổ sung thêm vào chế độ ăn uống hàng ngày nhằm duy trì, tăng cường, cải thiện các chức năng của cơ thể con người, giảm nguy cơ mắc bệnh”

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa một, nhiều hoặc hỗn hợp các chất sau:

- Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid b o, enzyme, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác;

- Chất có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm động vật, khoáng vật và thực vật dưới dạng chiết xuất, phân lập, cô đặc hay chuyển hóa;

- Các nguồn tổng hợp của những thành phần được đề cập trên

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe được trình bày ở dạng chế biến như viên nang, viên hoàn, viên nén, chế phẩm dạng cốm, bột, lỏng và các dạng bào chế khác, được phân liều thành các đơn vị liều nhỏ để sử dụng.

b. Lợi ích của thực phẩm bảo vệ sức khỏe

- Bổ sung nhanh chóng chất dinh dưỡng và các chất có tác dụng chức năng mà cơ

thể không được cung cấp đầy đủ trong chế độ ăn uống hàng ngày

- Có thể tạm thời thay thế bữa ăn khi không có điều kiện ăn uống bình thường

như khi ở môi trường thiếu thốn thực phẩm hoặc không thể ăn được vì l do bệnh tật

- Các chế phẩm đều ở dạng tinh chế rất tiện lợi, dễ sử dụng và bảo quản

- Có nhiều sản phẩm để chọn lựa ph hợp với tình trạng cơ thể từng người

- Mua và d ng dễ dàng không cần phải có thầy thuốc khám bệnh kê toa

- Khi sử dụng thực phẩm chức năng, người sử dụng sẽ có thức chăm lo cho sức khoẻ, thay đổi thói quen để có chế độ ăn uống hợp l và lối sống lành mạnh có lợi cho sức khoẻ hơn

- Nguồn cung cấp dồi dào thường xuyên, mạng lưới rộng khắp

1.2.4.2. Tổng quan nguyên liệu chính sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe của đề tài

- Bột rễ mật nhân: Sản xuất cao chiết để sử dụng trực tiếp và bổ sung vào dây chuyền sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

- Nụ vối: Có tác dụng bình ổn đường huyết lâu dài, hỗ trợ giảm mỡ máu, chống oxy hóa, trị bệnh đái tháo đường Các nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh nụ vối có nhiều tác dụng sinh học như:

- Kháng viêm [43];

- Kháng khuẩn [44];

- Kháng ung thư [45] [46];

- Tăng cường và kích thích tiêu hóa [46].

Rau má: Là loại rau tương đối phổ biến, có nhiều hoạt tính sinh học đáng qu đối với sức khỏe con người, thường thu hái cả lá và dây Rau má được d ng như thực phẩm và thuốc trong dân gian, rau má có vị hơi đắng, ngọt, tính hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tán ứ chỉ thống, lương huyết sinh tân, lợi niệu Rau má thường d ng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả l , khí hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy. Trong rau má có alkaloid là hydrocotulin và các glycosid, asiaticoside và centellosid, có tác dụng tới các mô liên kết, giúp cho các mô tái tạo nhanh chóng, do đó làm các vết thương mau lành và lên da non [47].

Vào năm 2009, nhóm nghiên cứu Frederico Pittella và cộng sự đã công bố rằng dịch chiết rau má có hoạt động đáng kể chống lại khối u ác tính ở chuột (B16F1), ung thư vú ở người (MDA MB-231) và các dòng tế bào chuột glioma (C6), với các giá trị

IC50 lần lượt 698 g/mL, 648 g/mL và 1000 g/mL [48].

1.2.4.3. Quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Thực phẩm nói chung và thực phẩm bảo vệ sức khỏe nói riêng để được công nhận và được thương mại hóa bắt buộc phải tuân thủ quy định về chất lượng của sản phẩm thực phẩm theo Luật an toàn thực phẩm 55/2010/QH12 [49]; Nghị định số 15 năm 2018 về việc quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật an toàn thực phẩm [50]. Bên cạnh đó, hàm lượng chất bổ sung vào sản phẩm phải tuân theo quy định của Thông tư số 43/2014/TT-BYT - quy định về quản l thực phẩm chức năng [51]; Thông tư 18/2019/TT-BYT – hướng dẫn thực hành sản xuất tốt GMP trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe [52]. Vì vậy, quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe về cơ bản bao gồm các nội dung sau đây:

- Khảo sát hàm lượng bổ sung hoạt chất có hoạt tính sinh học;

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất ;

- Kiểm tra chất lượng sản phẩm;

- Xây dựng dự thảo công bố sản phẩm trình cơ quan quản l nhà nước chuyên ngành thẩm định và phê duyệt

a. Khảo sát hàm lượng bổ sung hợp chất có hoạt tính sinh học

Việc bổ sung một lượng hợp chất có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ thiên nhiên vào thực phẩm sẽ ảnh hưởng đến chỉ tiêu chất lượng sản phẩm thành phần hóa học, cảm quan v v… , đặc biệt, với mật nhân có vị đắng hậu vị rất khó chịu, phương pháp chế biến nhằm giảm thiểu sự hao hụt, biến tính hoạt chất Trên cơ sở khảo sát hàm lượng hợp chất có hoạt tính cần bổ sung, tiến hành xây dựng quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

b. Xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất của một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe quy mô phòng thí nghiệm với nguyên liệu chính được nêu ở mục 1.2.4.2 và một số nguyên liệu bổ sung khác.

c. Kiểm tra chất lượng sản phẩm

Kiểm tra chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhằm đảm bảo sản phẩm đạt các chỉ tiêu chất lượng với liều lượng chất bổ sung đã xác định, đánh giá cảm quan thị hiếu người d ng, đồng thời, phải đảm bảo các chỉ tiêu an toàn thực phẩm

theo quy định hiện hành.

Đây là cơ sở để nhà sản xuất xây dựng bản công bố chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe và là một trong các tiêu chí quan trọng để đưa sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe ra thị trường

d. Công bố chất lượng sản phẩm

Trường hợp công bố sản phẩm tự sản xuất, căn cứ điều 10, Thông tư 43/2014/TT-BYT, cá nhân, tổ chức cần đảm bảo các yêu cầu sau:

- Thành phần chính tạo nên công dụng của sản phẩm phải được liệt kê trước c ng tên đầy đủ và hàm lượng Các thành phần khác được liệt kê tiếp sau theo thứ tự giảm dần về khối lượng;

- Hàm lượng của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên d ng hằng ngày của nhà sản xuất phải đạt được tối thiểu 15 % RNI;

- Hàm lượng tối đa của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên dùng hằng ngày của nhà sản xuất không được vượt quá ngưỡng dung nạp tối đa của các vitamin và khoáng chất được quy định;

- Hàm lượng vitamin và khoáng chất có trong sản phẩm phải được ghi trên nhãn bằng số và phải được công bố dưới dạng tỷ lệ phần trăm % tính theo RNI, dựa trên liều khuyên d ng hằng ngày của sản phẩm hoặc dựa trên một đơn vị sử dụng (serving size).

Trường hợp Việt Nam chưa có mức RNI và ngưỡng dung nạp tối đa thì áp dụng theo quy định của CODEX hoặc các tổ chức quốc tế có liên quan.

- Công bố khuyến cáo về sức khỏe Health claims :

Công bố khuyến cáo về sức khỏe phải đúng bản chất của sản phẩm, chỉ công bố công dụng của thành phần cấu tạo có công dụng chính hoặc công bố công dụng hợp thành của những thành phần cấu tạo khi có bằng chứng khoa học chứng minh và không công bố công dụng theo cách liệt kê công dụng của các thành phần;

Công bố khuyến cáo về sức khỏe, liều lượng, đối tượng sử dụng và cách d ng ph hợp phải thống nhất và ph hợp với các tài liệu tại hồ sơ;

Khi hàm lượng vitamin, khoáng chất, các hoạt chất sinh học nhỏ hơn mức trong các tài liệu khoa học chứng minh thì không được công bố công dụng sản phẩm;

Khi hàm lượng vitamin, khoáng chất, các hoạt chất sinh học đạt như trong tài

liệu khoa học khuyến cáo thì được công bố công dụng nhưng phải chỉ ra đối tượng, liều d ng ph hợp;

Khi hàm lượng các thành phần cấu tạo chưa có mức RNI thì phải cung cấp tài liệu khoa học chứng minh về công dụng của thành phần đó c ng khuyến cáo liều d ng khi công bố

- Đối tượng sử dụng:

Đối tượng phải ph hợp với công dụng đã công bố và được cơ quan nhà nước có thẩm quyền chấp nhận thông qua Bản xác nhận công bố ph hợp quy định an toàn thực phẩm;

Phải cảnh báo đối tượng không được sử dụng nếu có

1.3. Tổng quan về tình hình nghiên cứu mật nhân trong và ngoài nước

Từ nhiều năm trước, các kết quả nghiên cứu về cây mật nhân ở nước ta và trên thế giới đã được công bố, đặc biệt là rễ của chúng, các nghiên cứu chủ yếu đề cập đến thành phần hóa học của các chất phân lập được, khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết và một số ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm có lợi cho sức khỏe.

1.3.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về phân lập, xác định thành phần hóa học của nhiều hợp chất đã được công bố từ những năm 1960 của thế kỷ trước, có thể nêu một số kết quả nghiên cứu sau:

Năm 1968, nhóm nghiên cứu Lê Văn Thới và Nguyễn Ngọc Sương đã phân lập được hợp chất β-sitosterol, campesterol, 2,6- dimetoxybenzoquinon và một số hợp chất có vị đắng là eurycomalacton từ cao chiết ête dầu trích từ vỏ và lá cây mật nhân bằng kỹ thuật sắc ký cột hấp phụ trên alumin [53].

Năm 1982, nhóm nghiên cứu thuộc Trường Đại học Y Dược Hiroshima, Nhật đã phân lập được hai hợp chất quassinoid có số oxy hoá cao có tên là eurycomanone và eurycomanol từ rễ cây mật nhân có nguồn gốc Indonesia [54].

Năm 1986, nhóm nghiên cứu của K.L.Chan và cộng sự đã tìm thấy hợp chất mới thuộc nhóm quassinoid là 3,4-dihyroeurycomalacton, 5,6-dehyroeurycomalacton, 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalacton và nhóm alkaloid có tên là 10-hydroxycantin- 6-on, tinh thể màu vàng từ cao ête dầu trích từ rễ cây mật nhân. Ngoài ra, từ cao chloroform của rễ cây cũng phát hiện được một hợp chất coumarin là scopoletin [55].

Năm 1989, nhóm nghiên cứu của K L Chan và cộng sự đã phân lập được một quassinoid glycoside có tên là eurycomanol-2-O- -D-glucopyranosid trích từ cao n- butanol của rễ cây mật nhân [56].

Năm 1982, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sương và công sự đã phân lập được hai hợp chất laurycolactone A và laurycolactone B, chúng là các quassinoid có bộ xương cơ bản C18 [57].

Tiếp theo vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của K L Chan và cộng sự đã phân lập được từ hợp chất 13β,18-dihydroeurycomanol, kết tinh trong methanol từ dịch trích từ rễ cây với ête dầu [58].

Nhóm Kadono và công sự đã công bố kết quả nghiên cứu các thành phần gây độc tế bào và chống sốt r t của rễ, đã phân lập được bốn alkaloid thuộc nhóm canthin- 6-one đó là 9-methoxycanthin-6-one, 9-methoxycanthin-6-one-N-oxide, 9- hydroxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one-N-oxide và -carboline-1-propionic acid vào năm 1991 [59].

Cũng vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của H Tada và cộng sự đã phân lập được hợp chất paskbumin A eurycomanon và hai hợp chất mới cũng có khung sườn quassinoid là pasakbumin B, pasakbumin C từ cao chiết methanol [60]. Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học y dược, Tokyo - Nhật trong quá trình nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây mật nhân đã phân lập được hai hợp chất mới với khung squallan Đây đồng thời là hai đồng phân lập thể của nhau, một là eurylen, một là teurylen, cả hai đều có dạng tinh thể không màu, có công thức phân tử là C34H58O8 [61].

Năm 1993, nhóm nghiên cứu của H Itokawa và cộng sự đã phân lập được một

hợp chất mang khung squallan tên là longilen peroxide, là một hợp chất không màu, có công thức phân tử là C30H52O8 [62].

Vào năm 2014, nhóm nghiên cứu của Seon Ju Park và cộng sự đã phân lập và

định danh cấu trúc của năm hợp chất thuộc nhóm quassinoid: Eurylactone E, eurylactone F, eurylactone G, eurycomalide D, and eurycomalide E [63].

Năm 2015, nhóm nghiên cứu Lê Thị Huyền và cộng sự đã phân lập được 3 chất thuộc nhóm quassinoid từ dịch chiết methanol của rễ cây mật nhân: Pasakbumin-C, 13α,21-epoxyeurycomanone and eurylactone A [64].

Năm 2017, nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Tùng và cộng sự đã tìm ra một