Thử Nghiệm Sinh Sản Lươn Đồng Với Nguồn Bố Mẹ Không Được Nuôi Vỗ Thành Thục (Thí Nghiệm 2)

- Tỷ lệ thành thục

Số lươn thành thục (TSD giai đoạn IV)

Tỷ lệ thành thục = x 100

Số lươn thu mẫu

- Hàm lượng vitellines trong huyết tương

3.4.2 Thử nghiệm sinh sản lươn đồng với nguồn bố mẹ không được nuôi vỗ thành thục (thí nghiệm 2)

- Nguồn lươn bố mẹ

Lươn bố mẹ được mua từ trại nuôi thương phẩm, trữ lại một tuần trong bể composite 4 m3 có sụt khí, cho ăn tép tươi trước khi cho tham gia sinh sản.

Khối lượng trung bình của lươn bố mẹ lần lượt là 185 g và 127 g với chiều dài tương ứng là 45 cm và 51 cm.

- Hệ thống bể cho đẽ

Hệ thống bể gồm 18 bể composite (500 L/bể) có ụ đất cao 40 cm chiếm 50% diện tích đáy bể, có sục khí, các bể có thoát nước ở một bên. Nước được cấp vào ở bề mặt ở dạng phun mưa. Nguồn nước cung cấp cho hệ thống từ giếng khoang qua hệ thống lọc và được trữ trong bồn chứa.

Hình 3.2: Hệ thống bể thí nghiệm của thí nghiệm 2 và 3

- Bố trí thí nghiệm cho đẽ từ nguồn lươn không được nuôi vỗ

Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức. Nghiệm thức I: Không tiêm kích dục tố.

Nghiệm thức II: Tiêm LHRH-a với liều lượng 150 g/kg thể trọng.

Nghiệm thức III: Tiêm HCG liều sơ bộ 1.000 UI/kg và 24 giờ sau tiêm liều quyết định 2.000 UI/kg.

Mỗi bể được bố trí 1 lươn đực và 1 lươn cái. Mỗi nghiệm thức sẽ có 6 cặp lươn cho đẻ. Lươn cái có bụng to, mềm lổ sinh dục ửng hồng. Lươn đực, khi vuốt có tinh dịch chảy ra.

- Quản lý cho ăn

Cho ăn bằng tép tươi, trùng quế trữ ở -40C.

Cho ăn mỗi ngày 1 lần (16h) từ lúc bố trí lươn vào bể sinh sản. Cho ăn theo nhu cầu, lượng thức ăn sử dụng được ghi nhận hàng ngày và khẩu phần ăn khoảng 5-6% trọng lượng thân. Điều chỉnh lượng thức ăn hàng tuần.

- Theo dòi các chỉ tiêu môi trường

Nhiệt độ: Đo bằng nhiệt kế 2 lần/ngày (sáng 8 giờ và chiều 16 giờ); pH: Đo bằng máy đo pH, 1 lần/tuần (sáng 8 giờ và chiều 16 giờ); oxy: Máy 556 YSI (USA), 1 lần/tuần (sáng 8 giờ và chiều 16 giờ); TAN: Xác định bằng phương pháp Indophenolblue, 1 lần/tuần; NO2-: Xác định bằng phương pháp

Greshosway, 1 lần/tuần; NO3-: Xác định bằng phương pháp Salycilate, 1

lần/tuần.

- Theo dòi các chỉ tiêu sinh sản Phương pháp thu mẫu:

Quan sát các tổ trứng và thu trứng. Các bước tiến hành gồm:

+ Đếm số lượng trứng.

+ Cân khối lượng và đo chiều dài của lươn bố mẹ.

Xác định các chỉ tiêu sinh sản:

* Tỷ lệ sinh sản: Ghi nhận trong thời gian 3 tháng.

Số lươn đồng sinh sản

Tỷ lệ sinh sản = x 100

Số lươn đồng tham gia sinh sản

* Tỷ lệ thụ tinh

Số trứng thụ tinh

Tỷ lệ thụ tinh = x 100

Số trứng quan sát

Số trứng nở

Tỷ lệ nở =

x 100

Số trứng thụ tinh

* Tỷ lệ nở

* Số lần sinh sản: Ghi nhận trong thời gian 3 tháng.

* Chu kỳ sinh sản: Thời gian giữa 2 lần sinh sản liên tiếp.

* Tỷ lệ sống sau 1 tháng: Tỷ lệ giữa số lượng lươn nở và số lượng lươn sống sau 1 tháng.

- Hạch toán giá thành của lươn giống

3.4.3 Thử nghiệm sinh sản lươn đồng với nguồn bố mẹ được nuôi vỗ thành thục (thí nghiệm 3)

- Nguồn lươn nuôi vỗ

Lươn bố mẹ được mua từ các trại nuôi thương phẩm, được trữ lại một tuần rồi tiến hành nuôi vỗ. Lươn đồng được nuôi vỗ trong 3 bể composite (500 L/bể), mật độ 30 con/bể. Bên trong bể bố trí dây nylon đen buộc thành chùm làm nơi trú ẩn cho lươn. Thức ăn cho lươn là tép nhỏ tươi, cá biển phi lê cắt nhỏ trữ trong tủ đông ở -40C. Lươn được tiêm HCG liều 300 UI/kg, 7 ngày

tiêm 1 lần, 4 lần/tháng để nâng cao hệ số thành thục. HCG được pha (10.000 UI/10 ml) nước cất, lắc đều cho tan trước khi tiêm. Tiến hành cân khối lượng từng con để xác định thể tích dung dịch HCG cần tiêm theo công thức:

d x c V(HCG ) = m

107

 V thể tích HCG cần tiêm (ml)

 m khối lượng của lươn đồng (g)

 d độ pha loãng của kích thích tố (ml)

 c liều lượng HCG cần tiêm (UI/kg)

 107: 1000 (1 kg = 1000g) x 10.000 (10.000 UI)

Sau 1 tháng nuôi vỗ lươn sẽ được tiến hành cho sinh sản.

- Hệ thống bể thí nghiệm

Hệ thống bể gồm 18 bể composite (500 L/bể) có ụ đất cao 40 cm chiếm 50% diện tích đáy bể, có sục khí, các bể có thoát nước ở một bên. Nước được cấp vào ở bề mặt ở dạng phun mưa. Nguồn nước cung cấp cho hệ thống từ giếng khoang qua hệ thống lọc và được trữ trong bồn chứa.

- Thức ăn thí nghiệm

Tép nhỏ tươi, trùng quế, trữ trong tủ đông ở -40C.

- Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức. Nghiệm thức I: Không tiêm kích dục tố.

Nghiệm thức II: Tiêm LHRH-a với liều lượng 150 g/kg thể trọng.

Nghiệm thức III: Tiêm HCG liều sơ bộ 1.000 UI/kg và 24 giờ sau tiêm liều quyết định 2.000 UI/kg.

Mỗi bể được bố trí 1 lươn đực và 1 lươn cái. Mỗi nghiệm thức có 6 cặp lươn cho đẻ. Lươn cái có bụng to, mềm lổ sinh dục ửng hồng. Lươn đực, khi vuốt có tinh dịch chảy ra.

- Quản lý cho ăn

Cho ăn mỗi ngày 1 lần (16h). Cho ăn theo nhu cầu, lượng thức ăn sử dụng được ghi nhận hàng ngày và khẩu phần ăn khoảng 5-6% trọng lượng thân. Điều chỉnh lượng thức ăn hàng tuần.

- Theo dòi các chỉ tiêu môi trường và các chỉ tiêu sinh sản giống như ở thí nghiệm 2

- Hạch toán giá thành của lươn giống

3.5. Phương pháp phân tích Vitellines

Để xác định được hàm lượng Vitellines trước hết cần xác định hàm lượng protein và alkalilabile phosphate (ALP) có trong huyết tương.

Xác định hàm lượng Protein

Lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry và ctv (1951), sử dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn.

Chuẩn bị hóa chất:

BSA: 10 mg/ml H2O.

Hỗn hợp A: 150ml Na2CO3 + 1,5ml CuSO4 + 1,5ml NaK Tartrate 2%. Folin: 10 ml Folin + 10 ml H2O.

Quá trình phân tích protein Bảng 3.1. Các bước phân tích protein

Hóa chất Đường chuẩn Mẫu

0 mg protein	0,05 mg protein	0,1 mg protein	0,2 mg protein	0,5 mg protein
BSA	0 µl	5 µl	10 µl	20 µl	0,5 µl
Mẫu	/	/	/	/	/	10
H2O	500 µl	495 µl	490 µl	480 µl	450 µl	490 µl
NaOH 1N	500 µl	500 µl	500 µl	500 µl	500 µl	500 µl

Có thể bạn quan tâm!

• Nghiên cứu tuổi thành thục và thử nghiệm sinh sản lươn đồng (monopterus albus zuiew, 1793) - 1
• Nghiên cứu tuổi thành thục và thử nghiệm sinh sản lươn đồng (monopterus albus zuiew, 1793) - 2
• Những Nghiên Cứu Về Sản Xuất Giống Lươn Đồng
• Tăng Trưởng Về Chiều Dài Và Khối Lượng Của Lươn Đồng Bảng 4.2. Tăng Trưởng Về Khối Lượng Của Lươn Đồng
• Tỷ Lệ Sinh Sản Của Lươn Đồng Ở Các Nghiệm Thức Sử Dụng Kích Dục Tố Khác Nhau Ở Thí Nghiệm 2 (Không Nuôi Vỗ) Và Thí Nghiệm 3 (Nuôi Vỗ).
• Tỷ Suất Lợi Nhuận Của Các Nghiệm Thức Ở Thí Nghiệm 3

Xem toàn bộ 97 trang tài liệu này.

Ủ trong 30 – 120 phút

Hỗn hợp 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

Ủ trong 15 phút

Folin 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl

Ủ trong 30 phút

Đọc ở bước sóng 660 nm

Đường chuẩn Albumine bovine cho phép xác định được lượng protein (mg protein/ml plasma) có trong mẫu.

Xác định alkali – labile phosphate (ALP)

ALP được xác định dựa vào đường chuẩn phosphorus standard.

Hóa chất phân tích:

Acid Molybdate: 0,625 g Amonium molydate /50 ml H2SO4 2,5 M Reducer: 1,58 g/10 ml H2O

TCA 20%: 20 g Trichloro acetic acid /100 ml H2O NaOH 2N: 8 g/100 ml H2O

HCl: 16,6 ml/83,4 ml H2O

Absolute ethanol, acetone, diethyllether, chloroform

Qui trình phân tích

30 µl plasma + 1 ml TCA 20% trong 15 phút

Ly tâm trong 10 phút (40C): RPM = 3300 rpm. Dùng pipet lấy phần cô đặc 1 ml Ethanol

Để vào nước nóng 600C trong vòng 10 phút

Ly tâm 2 phút (40C): RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc 1ml Chloroform: 2 ml Diethyllether: 2 ml Ethanol trong 5 phút

Ly tâm 2 phút (40C): RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc

1ml Aceton trong 5 phút

Ly tâm 2 phút (40C): RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc 1ml Diethyllether trong 5 phút

Ly tâm 2 phút (40C): RPM = 8000 rpm.

Lấy phần cô đặc sấy khô khoảng 1 giờ ( 50 – 600C) 500 µl NaOH 2N

Để vào nước nóng 1000C trong 15 phút. Lấy ra để nguội.

500 µl HCl 2N

Dùng pipet hút 400 µl mẫu cho vào ống nghiệm rồi tiến hành như sau:

Nồng độ đường chuẩn phospho Bảng 3.2. Các bước phân tích phosphor

		standard		Molybdate
Mẫu	400	/	400	200	50	1050
Đường
chuẩn
0 µl	/	/	800	200	50	1050
0,2 µl	/	10	790	200	50	1050
0,5 µl	/	25	775	200	50	1050
1 µl	/	50	750	200	50	1050
2 µl	/	100	700	200	50	1050
4 µl	/	200	600	200	50	1050
6 µl	/	300	500	200	50	1050

Mẫu Phosphorus

Nước Acid

Reducer Tổng

Chờ 10 phút

So màu ở bước sóng 660 nm

Thiết lập phương trình tương quan cho mẫu chuẩn từ đó dựa trên đường chuẩn và độ hấp thu để tính toán hàm lượng ALP (µg ALP/ml plasma) trong mẫu.

Công thức tính toán hàm lượng Vitellines:

µg ALP/ml plasma µgALP

Vitellines = =

mg protein/ml plasma mg protein

3.6. Phương pháp mô học

Tiêu bản mô học được thực hiện theo phương pháp Drury, Wallington (1967) và J.A.Kiernan (1990).

Mẫu tuyến sinh dục đã được bảo quản trong dung dịch cồn 70%, sau khi cố định tuyến sinh dục được cắt ra thành phần nhỏ với độ dày 3–5 mm cho vào histocasset và ngâm trong cồn 70% đến khi xử lý.

Quá trình xử lý mẫu

Cồn 80% (1h) € Cồn 95% (1h) € Cồn 95% (1h) € Cồn 100% (1h) €

Cồn 100% (1h) € Cồn 100% (1h) € Xylen (2h) € Xylen (2h) € Xylen (2h)

€ Paraffin + xylen (5:5) (2,5h) € Paraffin + sáp ong (5:5) (2h) € Paraffin + sáp ong (7:3) (2h)

Đúc khối

Sau khi xử lý xong đặt mẫu trong khung paraffin khoảng 30 phút để

mẫu ngấm paraffin tốt.

Sau đó dùng kẹp gấp mẫu trong khung đặt trong khung inox, định hướng mẫu cho đúng rồi đổ paraffin nóng chảy (57 – 600C) vào khuôn, đồng thời làm lạnh khuôn để mẫu được cố định vững chắc, ấn cho mẫu sát vào đáy khuôn, tiếp tục đổ paraffin vào đầy khuôn.

Đặt vào ngăn lạnh hay tủ lạnh để paraffin đặc lại.

Lấy khối mô khỏi khuôn và đặt vào tủ lạnh để làm rắn lại.

Cắt mẫu

Tiếp theo mẫu được cắt thành từng băng dài và mỏng bằng máy cắt mô (microtone) với độ dày 4–6 µm, dùng kim mũi giáo tách lấy đoạn mẫu không bị vỡ và đặt lát cắt lên lam đã nhỏ sẵn một ít nước ấm (45–500C) cho lát cắt căng ra.

Cho lên bàn sấy (slide warmer) với nhiệt độ từ 45–500C trong thời gian 12–24 giờ để paraffin tan ra và mẫu được khô.

Quy trình nhuộm và dán mẫu

Xylen (5 phút) € Xylen (5 phút) € Xylen (5 phút) € Cồn 100% (5 phút) € Cồn 100% (5 phút) € Cồn 70% (5 phút) € Rửa nước (5 phút) € Hematoxylin (2 phút) € Rửa nước (1 phút) € Rửa nước (1 phút) € Eosin (1 phút) € Cồn 95% (5 phút) € Cồn 100% (5 phút) € Cồn 100% (5 phút) € Xylen (5 phút) € Xylen (15 phút)

Dán lamelle vào vùng có mẫu trên lam bằng keo Canada balsam. Làm khô mẫu.

Đọc kết quả

3.7. Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng chương trình Microsof Exell và phần mềm thống kê SPSS14.0 với kiểm định Ducan và thống kê mô tả.