Ảnh Hưởng Ph Đến Mức Độ Thủy Phân Bằng Enzyme Neutral Sau 9 Giờ.

Từ kết quả phân tích thống kê sau 9 giờ thủy phân cho thấy giữa các mức độ thủy phân có sự khác biệt về mặt thống kê khi thay đổi nhiệt độ thủy phân. Điều này chứng tỏ có sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả quá trình thủy phân.

Khi thủy phân ở 40oC, 50oC và 60oC, mức độ thủy phân sau 9 giờ tương ứng là 26,80%, 31,07% và 35,29%. Ở nhiệt độ 60oC mức độ thủy phân đạt cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với ở nhiệt độ 40oC và 50oC. Vì vậy, nhiệt độ 60oC là thích hợp cho sự hoạt động của enzyme neutral với cơ chất là protein thịt cá sấu.

c) Khảo sát ảnh hưởng của pH

Để khảo sát ảnh hưởng của pH, thí nghiệm được thực hiện ở các pH 5; 6; 7 và 8 với nhiệt độ cố định 60oC và tỷ lệ enzyme neutral 3%. Mức độ thủy phân sau 9 giờ khi thực hiện ở các pH khác nhau được thể hiện trong Hình 3.13.

Hình 3.13. Ảnh hưởng pH đến mức độ thủy phân bằng enzyme neutral sau 9 giờ.

Chú thích: Các kí tự (a, b, c) thể hiện sự khác biệt mức độ thủy phân tại các pH khác nhau. Các giá trị không có cùng ký tự thì khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95 %.

Khi thủy phân ở các pH khác nhau, mức độ thủy phân đạt được ở các mẫu pH 5, 6, 7, 8 lần lượt là 27,79%, 36%, 39,02% và 35,45%. Mức độ thủy phân ở mẫu pH 7 cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với ở pH 5, 6 và 8 sau cùng thời gian. Vì vậy, pH 7 là thích hợp cho sự hoạt động của enzyme neutral với cơ chất là protein thịt cá sấu.

Dựa vào kết quả khảo sát trên, có thể đề xuất điều kiện thủy phân thích hợp cho protein thịt cá sấu bằng enzyme neutral như sau: nhiệt độ thủy phân 60oC, pH 7 và tỷ lệ enzyme 3%.

3.3.1.2Thủy phân bằng enzyme alcalase

a) Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme alcalase

Thủy phân bằng enzyme alcalase thực hiện ở pH 7,5 và nhiệt độ 52,5oC.

Hình 3.14. Độ thủy phân thịt cá sấu theo thời gian ở các tỉ lệ bổ sung enzyme alcalase khác nhau

Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme alcalase đối với mức độ thủy phân được trình bày ở Hình 3.14, cho thấy mức độ thủy phân khi sử dụng enzyme alcalase cũng tăng theo thời gian thủy phân. Độ thủy phân tăng nhanh trong khoảng 5 giờ đầu và có xu hướng tuyến tính trong các giờ thủy phân tiếp theo. Khi tăng tỷ lệ enzyme bổ sung mức độ thủy phân càng cao. Sau 9 giờ thủy phân, độ thủy phân đạt được tương ứng với các mẫu bổ sung 0,05%, 0,075% và 0,1% là 6,77%, 18,66% và 22,48%. Độ thủy phân cao nhất khi tỉ lệ enzyme alcalase bổ sung là 0,1%.

b) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Quá trình thủy phân được thực hiện với tỉ lệ enzyme alcalase bổ sung 0,1%, pH dịch trước khi đem thủy phân được chỉnh về 7,5 và nhiệt độ được thực hiện tại các mốc 45oC, 55oC và 65oC.

Mức độ thủy phân sau 9 giờ khi thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau được thể hiện trong Hình 3.15.

Từ kết quả phân tích thống kê sau 9 giờ thủy phân và Hình 3.15 cho thấy khi tăng nhiệt độ thủy phân từ 45oC đến 55oC, độ thủy phân tăng từ 20,14% lên 24,26%. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 65oC mức độ thủy phân lại giảm xuống còn 19,72%. Độ thủy phân sau 9 giờ ở mẫu 55oC cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với độ thủy phân ở các nhiệt độ 45oC và 65oC.

Vì vậy, nhiệt độ 55oC là thích hợp cho enzyme alcalase hoạt động đối với cơ chất là thịt cá sấu.

Hình 3.15. Độ thủy phân thịt cá sấu bằng enzyme alcalase ở nhiệt độ khác nhau sau 9 giờ.

Chú thích: Các kí tự (a, b, c) thể hiện sự khác biệt độ thủy phân giữa các nhiệt độ. Các giá trị không có cùng ký tự thì khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%.

c) Khảo sát ảnh hưởng của pH

Để khảo sát ảnh hưởng của pH, thí nghiệm được thực hiện ở các pH 7 và 8 với nhiệt độ cố định 55oC và tỷ lệ enzyme alcalase 0,1%. Mức độ thủy phân sau 9 giờ khi thực hiện ở các pH khác nhau được thể hiện trong Hình 3.16.

Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân bằng enzyme alcalase sau 9 giờ

Chú thích: Các kí tự (a, b) thể hiện sự khác biệt độ thủy phân tại các pH khác nhau. Các giá trị không có cùng ký tự thì khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95 %.

Khi thủy phân ở các pH khác nhau, độ thủy phân đạt được cao nhất ở pH 8 (25,52%). Giá trị độ thủy phân này cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với ở pH 7 (22,20%) sau cùng thời gian. Do đó, pH 8 là phù hợp cho hoạt động của enzyme alcalase đối với cơ chất là thịt cá sấu.

Dựa vào kết quả khảo sát trên, đề xuất điều kiện thủy phân thích hợp cho protein thịt cá sấu bằng enzyme alcalase 2,4L như sau: nhiệt độ thủy phân 55oC, pH 8 và tỷ lệ enzyme 0,1%. Kết quả thăm dò này phù hợp với kết quả tối ưu trong nghiên cứu của Kurozawa và ctv (2008), khi tối ưu hóa thủy phân protein từ thịt gà bằng enzyme alcalase 2,4L cho các điều kiện tối ưu gồm nhiệt độ 52,5oC và pH 8.

3.3.1.3 Thủy phân bằng flavourzyme

a) Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme

Thủy phân bằng enzyme flavourzyme thực hiện ở pH 6 và nhiệt độ 52,5oC.

Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme flavourzyme đối với mức độ thủy phân được trình bày ở Hình 3.17.

Hình 3.17. Độ thủy phân thịt cá sấu theo thời gian ở các tỉ lệ bổ sung enzyme flavourzyme khác nhau.

Kết quả thí nghiệm Hình 3.17 cho thấy mức độ thủy phân cũng tăng dần theo thời gian thủy phân. Mức độ thủy phân khi sử dụng enzyme flavourzyme tăng đều khi tăng tỷ lệ enzyme từ 0,05% lên 0,2%. Độ thủy phân sau 9 giờ của các mẫu thủy phân ở các mức tỷ lệ E / S 0,05%; 0,125% và 0,2% đạt lần lượt 9,5%; 12,28% và 15,12%. Hiệu quả thủy phân ở mức tỷ lệ E/S 0,2% cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với hai mức tỷ lệ E / S 0,05% và 0,125%.

b) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Quá trình thủy phân được thực hiện với tỉ lệ enzyme flavourzyme bổ sung 0,2%, dịch trước khi đem thủy phân chỉnh về pH 6 và thực hiện tại 50oC và 55oC.

Mức độ thủy phân sau 9 giờ khi thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau được thể hiện trong Hình 3.18.

Hình 3.18. Độ thủy phân thịt cá sấu bằng enzyme flavourzyme ở nhiệt độ khác nhau sau 9 giờ

Chú thích: Ký tự a thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa giữa độ thủy phân và các nhiệt độ với độ tin cậy 95%.

Từ kết quả phân tích thống kê sau 9 giờ thủy phân cho thấy khi tăng nhiệt độ thủy phân từ 50oC đến 55oC, độ thủy phân giảm từ 16,86% xuống 15,59%. Độ thủy phân sau 9 giờ ở mẫu 50oC cao hơn và khác biệt không có ý nghĩa so với độ thủy phân ở các nhiệt độ 55oC. Vì vậy, để giảm chi phí, nhiệt độ 50oC là thích hợp cho enzyme flavourzyme hoạt động với độ thủy phân là 16,86% cơ chất là thịt cá sấu.

c) Khảo sát ảnh hưởng của pH

Để khảo sát ảnh hưởng của pH, thí nghiệm được thực hiện ở các pH 5,5 và 6,5 với nhiệt độ cố định 50oC và tỷ lệ enzyme flavourzyme 0,2 %. Mức độ thủy phân sau 9 giờ khi thực hiện ở các pH khác nhau được thể hiện trong Hình 3.19.

Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân bằng enzyme flavourzyme sau 9 giờ

Chú thích: Kí tự a thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa của độ thủy phân tại các pH khác nhau với độ tin cậy 95 %.

Khi thủy phân ở hai pH khác nhau, độ thủy phân đạt được sau 9 giờ ở pH 6,5 và pH 5,5 lần lượt là 16,64 % và 14,95 %. Giá trị độ thủy phân ở pH 6,5 cao hơn và khác biệt không có ý nghĩa so với ở pH 5,5. Tuy nhiên pH 6,5 gần với pH tự nhiên của dịch thịt cá sấu trước khi thủy phân (6,4). Do đó, pH 6,5 là phù hợp cho hoạt động của enzyme flavourzyme đối với cơ chất là thịt cá sấu.

Dựa vào kết quả khảo sát trên, có thể đề xuất điều kiện thủy phân thích hợp cho protein thịt cá sấu bằng enzyme flavourzyme như sau: nhiệt độ thủy phân 50oC, pH 6,5 và tỷ lệ enzyme 0,2%.

3.3.1.4 So sánh ba loại enzyme

Bảng 3-9. Mức độ thủy phân sau 9 giờ của ba enzyme ở điều kiện thủy phân (tỷ lệ enzyme, nhiệt độ, pH) đã thăm dò

Enzyme Điều kiện thủy phân Mức độ

% Enzyme bổ sung	pH	Nhiệt độ (oC)	thủy phân (%)
Flavourzyme	0,2	6,5	50	16,64 ± 1,45c
Alcalase	0,1	8,0	55	25,52 ± 1,40b
Neutral	3,0	7,0	60	39,02 ± 1,00a

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 224 trang tài liệu này.

Chú thích: Các kí tự (a, b, c) thể hiện sự khác biệt mức độ thủy phân giữa các enzyme. Các giá trị không có cùng ký tự thì khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%.

Khi so sánh ba mẫu thủy phân bằng ba enzyme ở điều kiện thủy phân tối ưu đã thăm dò với nhau, Bảng 3-9 cho thấy sau 9 giờ thủy phân thì mức độ thủy phân giữa ba enzyme khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Mức độ thủy phân đạt được của từng enzyme flavourzyme, alcalase và neutral lần lượt là 16,64%; 25,52% và 39,02%. Như vậy enzyme neutral có khả năng thủy phân thịt cá sấu cao hơn alcalase hoặc flavourzyme. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Fang và ctv (2012) trong nghiên cứu tối ưu hóa sản xuất dịch thủy phân chống oxy hóa từ protein cơ mực. Trong nghiên cứu tác giả thủy phân với năm loại enzyme

protease (pepsin, trypsin, papain, alcalase và flavourzyme). Kết quả cho thấy thủy phân bằng enzyme alcalase cho mức độ thủy phân cao hơn flavourzyme.

Kết quả cho thấy khi sử dụng enzyme flavourzyme, hiệu quả thủy phân thấp nhất sau đó là alcalase và neutral có mức độ thủy phân cao nhất. Enzyme flavourzyme có mức độ thủy phân thấp nhất nên phân cắt các peptide yếu hơn do đó sản phẩm thủy phân có chứa các peptide có khối lượng phân tử lớn, tiếp theo là các peptide của dịch thủy phân bằng alcalase và dịch thủy phân bằng neutral chứa các peptide có khối lượng phân tử nhỏ nhất. Chứng tỏ mức độ thủy phân cao hơn dẫn đến số lượng các peptide phân tử thấp nhiều hơn. Kết quả này phù hợp với kết quả của Mitsuda và cộng sự (1966) trong nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa của các hợp chất indole trong suốt quá trình oxy hóa của acid linoleic.

3.3.2 Tối ưu hóa thủy phân protein thịt cá sấu bằng enzyme neutral

Nhằm đánh giá quá trình tối ưu hóa thủy phân protein thịt cá sấu bằng enzyme neutral, phương pháp quy hoạch hóa thí nghiệm với mô hình thiết kế Box- Behnken (BBD – thiết kế thí nghiệm theo mô hình ngẫu nhiên đầy đủ của Box - Behnken) được áp dụng với ba biến X1 (T), X2 (pH), X3 (tỷ lệ enzyme/ cơ chất). Ba yếu tố khảo sát được nghiên cứu ở 3 mức mã hóa (-1, 0, +1) ở Bảng 3-10 và gồm 15 đơn vị thí nghiệm ở Bảng 3-11.

Hàm mục tiêu là mức độ thủy phân, %DH (Y1) và hoạt tính bắt giữ gốc DPPH oxy hóa, % DPPH (Y2).

	-1	0	1
X1: Nhiệt độ (oC)	55	60	65
X2: pH	6,5	7	7,5
X3: [E] / [S]a (%)	2,5	3	3,5

Bảng 3-10. Các mức thí nghiệm với ba biến X1(T), X2(pH), X3 (E/S) Các biến độc lập Các giá trị được mã hóa

Chú thích: a: tỷ lệ giữa khối lượng enzyme trên khối lượng protein trong mẫu.